神经肽urocortinⅡ对吗啡成瘾大鼠中脑腹侧被盖区神经元自发放电的影响

郑久明，张 迪，刘新宇，刘春娜

（辽宁医学院1.药理学教研室、2.附属第一医院，辽宁锦州 121001）

吗啡等阿片类药物反复使用可造成耐受、依赖和成瘾，中断给药出现戒断综合征、强迫觅药行为及戒断后焦虑等精神神经系统症状，对患者的身心有严重影响。目前已知，中脑边缘－多巴胺系统与药物成瘾和强化作用形成密切相关，此系统起自中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA），投射到杏仁中央核（nucleus centralis amygdalae，NAC）、内侧前额叶皮层（mPFC）等前脑区域，并涉及多种神经递质的投射。其中VTA是中脑的重要神经核团，在此系统中发挥非常关键的作用，因此受到人们的关注。神经肽urocortin（UCN）是由40个氨基酸组成的高活性神经肽，属促肾上腺皮质激素释放因子（CRH）家族，与CRF具有相似的生物学活性，通过下丘脑－腺垂体－肾上腺轴，促进腺垂体分泌肾上腺皮质激素，调节应激、应急反应，抗焦虑，镇静等作用［1］。虽然，UCN对吗啡成瘾影响有少量报道，但UCN对吗啡成瘾VTA神经元自发放电活动的影响未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Sprague-Dawley（SD）♂大鼠50只，体质量250～300 g，由辽宁医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK（辽）2008－0004。随机分为对照组10只和吗啡成瘾模型组40只。

1.2 吗啡成瘾大鼠模型的建立 按照12 d序列递增法［2］建立吗啡成瘾大鼠模型。

1.3 方法

1.3.1 麻醉开颅 大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯（1 g·kg－1）麻醉后，颅平位固定于脑立体定位仪（西北光学仪器厂，型号VDT-1）上，行常规开颅术。

1.3.2 定位及注药 根据Paxion＆Wastor大鼠脑图谱，确定VTA位置坐标为前囟后5.20～6.80 mm，中线旁开0.20～0.80 mm，脑表下7.0～8.0 mm。微电泳及细胞外记录使用51－217型微管拉制仪（美国STOELTING公司）所拉制的7管玻璃微电极［3］。中心管电阻5～12 MΩ，尖端直径10 μm，管内灌注含 1% 滂胺天蓝的 NaCl（3.0 mol·L－1）溶液；外周管电阻20～100MΩ，管内灌注不同浓度梯度UCNⅡ（10－5、10－6、10－7mol·L－1）及 Astressin-AST（CRFR2阻断剂）。

1.3.3 采集数据 微电泳仪（美国Dagan公司）设定给药电流为10～100 nA，给药时间为20 s，滞流电流为10 nA，应用Spike5软件采集数据。

1.3.4 数据处理分析 应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，所得数据以表示。

2 结果

2.1 吗啡成瘾大鼠的行为学观察 40只大鼠ip盐酸吗啡，1只因个体差异药物过量致死，2只戒断症状不明显，其余均观察到戒断症状，且戒断症状评分均在15分以上，提示造模成功。

2．2 大鼠VTA神经元自发放电活动 记录到对照组大鼠32个神经元和模型组大鼠81个神经元自发放电。对照组大鼠VTA神经元平均放电频率为（10.58±4.13）Hz，模型组大鼠VTA神经元的平均放电频率为（23.16±8.38）Hz，比对照组明显增高（t＝6.024，P＜0.01）。大鼠VTA神经元出现3种放电形式：规则放电、不规则放电和爆发式放电［4］。模型组大鼠VTA神经元不规则放电神经元构成比明显增多，而对照组大鼠VTA神经元则以规则放电和不规则放电为主（Tab 1）。差异有统计学意义（χ2＝8.18，P＜0.05）。

Tab 1 Spontaneous discharge forms of VTA neurons in control and model groups

2．3 微电泳UCNⅡ及AST对模型组大鼠VTA神经元自发放电的影响 采集到81个模型组大鼠神经元放电，其中65个给予不同浓度梯度UCNⅡ，VTA神经元放电频率随药物浓度越高，有降低越明显的趋势（Tab 2），多为单个放电，偶见双向动作电位。单独给予AST，神经元放电频率加快，接着给予UCNⅡ，放电频率减慢（Tab 3）。

Tab 2 Effects of different concentrations of UCNⅡon VTA neuron spontaneous firing rates

Tab 3 Effects of UCNⅡand AST on VTA neuron spontaneous firing rates

3 讨论

该研究表明，吗啡成瘾大鼠VTA自发放电频率明显高于正常大鼠。因为VTA是愉悦系统或奖赏系统的重要部分，当产生奖赏行为时，能够刺激VTA神经元。而DA能神经元的胞体主要位于中脑VTA，其纤维投射主要到NAC区，构成奖赏系统，阿片类药物能直接或间接刺激这个区域，产生神经元异常高频放电。

实验过程中，微电泳UCNⅡ使吗啡成瘾大鼠VTA神经元自发放电频率明显减慢，说明UCNⅡ对其VTA神经元起抑制作用。单独微电泳AST可增加受试吗啡成瘾大鼠VTA神经元的自发放电频率，提示VTA神经元中有CRFR2的存在。小鼠敲除UCN后，焦虑行为增强，CRFR2受体敲除小鼠对应激反应超敏，提示CRFR2受体介导抗焦虑效应［5］。关于UCN与药物成瘾的关系，研究资料较少。可卡因戒断引起的长时程增强可被CRFR1和CRFR2拮抗剂阻断；在酒精戒断过程中，大鼠杏仁核细胞外CRF明显升高。上述结果提示：UCN可能通过CRFR2参与酒精成瘾及戒断后焦虑和觅药等行为的应激性反应。给予UCNⅡ期间，其抑制作用可被CRFR2阻断剂AST所拮抗，结果进一步提示UCNⅡ对VTA神经元的抑制效应可能是通过与CRFR2结合后发挥作用。

参考文献：

［1］ AlsiíJ，Roman E，Olszewski PK，et al.Inverse association of highfat diet preference andanxiety-like behavior：a putative role for urocortin2［J］.Genes Brain Behav，2009，8（2）：193－202.

［2］ 纪家涛，王新华，由振东，等.吗啡依赖大鼠模型的建立［J］.第二军医大学学报，1997，18（1）：81－2.

［2］ Ji JT，Wang X H，You ZD，etal.To establishmorphine dependent model of rats［J］.Academ JSecond Milit Med Univ，1997，18（1）：81－2.

［3］ 孙 莹，刘春娜，张 迪，等.微电泳urocortinⅡ对大鼠纹状体神经元自发放电及DA、ACH能神经传递影响［J］.中国药理学通报，2013，29（9）：1325－6.

［3］ Sun Y，Liu CN，Zhang D，et al.Effects of neuroactive peptide urocortinⅡ on striatum neuron′s spontaneous discharge and DA and ACH-ergic neurotransmission［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（9）：1325－6.

［4］ Cohen JY，Haesler S，Vong L，et al.Neuron-type-specific signals for reward and punishment in the ventral tegmental area［J］.Nature，2012，482（7383）：85－8.

［5］ Breu J，Touma C，Haelter SM，etal.Urocortin 2modulatesaspects of social behavior in mice［J］.Behav Brain Res，2012，233（2）：331－6.