甘草酸对AGEs培养肾小球系膜细胞及ECM表达的影响

侯绍章，郑芳芳，李 媛，高 岭

（1.宁夏医科大学病理学系，2.宁夏心脑血管疾病重点实验室，3.宁夏医科大学药学院，4.宁夏医科大学护理学院，宁夏银川 750004）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是常见的糖尿病慢性微血管并发症，是终末期肾衰的主要原因之一。糖尿病患者长期的高血糖与体内一些半衰期较长的蛋白质通过非酶糖化反应生成糖化终产物（advanced glycation endproducts，AGEs），这是DN的一个重要发病机制。肾小球系膜细胞膜存在AGEs受体，AGEs与系膜细胞特异性受体结合后，能影响一系列细胞因子的释放，并促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的产生，从而导致肾小球肥大、ECM积聚和肾小球硬化。生理条件下，ECM产生和降解的动态平衡处于机体的精确调控下。近年来的研究表明，由于糖代谢紊乱及其所导致的血流动力学、细胞因子、生长因子等多种因素综合作用会使ECM生成增加而降解减少，这成为DN发生、发展的重要原因。FN是一类重要的高分子糖蛋白，在正常肾组织主要分布于肾小球系膜区，彼此以纤维状结构相连，对维持肾小球正常结构起着重要的作用［1］。C-Ⅳ以胶原蛋白的非纤维形式存在，主要由上皮细胞、间质细胞、系膜细胞产生，它穿透整个肾小球形成胶原纤维网，并通过结合细胞黏附分子起到机械屏障作用，在ECM增殖中占主要成份［2］。

近年来，许多研究力求从草药中寻找抗糖尿病药，如紫檀榈［3］、海参虫草［4］和匙羹藤［5］等。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是从甘草中提取的含量最高的皂苷类成分，研究表明，GA表现出诸如抗溃疡、祛痰、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤、神经保护和增强免疫等多种药理作用［6－8］。本实验拟研究GA对AGEs培养的肾小球系膜细胞增殖、细胞周期及ECM的成分FN和C-Ⅳ的影响，为今后探讨GA治疗DN的作用及可能机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品及试剂 GA（日本东京化成工业公司，TCI），大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1（北纳创联生物技术研究院），AGEs（Millipore公司，121800-10MG），大鼠纤维连接蛋白ELISA试剂盒（博士德生物），大鼠Ⅳ型胶原酶联免疫试剂盒（CUSABIO），MTT试剂盒和细胞周期检测试剂盒（南京凯基），细胞培养基DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）。培养瓶、冻存管、96孔细胞培养板和吸管（Corning公司）。

1.1.2 实验仪器 CO2培养箱（NO.NUAIR-NU-5510E，美国），超净工作台（BCM-1300A，苏净安泰），CF16-RX高速低温离心机（日立公司），酶标仪（Bio-Tek），流式细胞仪（BD FACSCalibur），电子显微镜（BX61），蛋白成像系统（Bio-RAD）。

1.2 实验方法

1.2.1 HBZY-1细胞培养及分组 传代培养HBZY-1细胞，在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养，当细胞生长达到80%融合时，用0.25%胰酶消化（37℃消化1 min）传代，置于5%CO2培养箱内37℃孵育24 h。根据不同实验所需细胞数，取不同细胞用胰酶消化制成细胞悬液。根据实验需要，接种于96孔细胞培养板上或培养瓶里，继续培养48 h使细胞生长达融合。细胞分组为：BSA对照组（200 mg·L－1的 BSA）、AGEs组（200 mg·L－1）、AGEs＋甘草酸组。

1.2.2 MTT细胞增殖检测 取对数生长期的HBZY-1细胞，用胰酶消化后配成5×107·L－1悬液，接种到96孔培养板中，分为BSA对照组（200 mg·L－1）、AGEs组（200 mg·L－1）、AGEs＋甘草酸组，甘草酸浓度依次设为（12.5、25、50、100、200、400 μmol·L－1），每组设 5个复孔，各组设 3个生物学重复。每孔加入悬液100μl，24 h贴壁换液后，按实验分组分别处理48 h，每孔加入50μl 1×MTT（5 g·L－1）孵育 4 h，镜下观察，MTT掺入细胞内，吸出上清，加入150μl DMSO使细胞内甲臜溶解，用平板摇床摇匀振荡10 min，待细胞完全溶解后，放入自动酶标仪490 nm波长读数，并记录OD值，确定甘草酸的剂量。

1.2.3 细胞周期检测 将接种密度为1×109·L－1的HBZY-1细胞分组后分别处理48 h，收集细胞，用PBS洗两次，加70%的乙醇固定细胞，4℃过夜，次日离心（4℃，1 000 r·min－1，10 min）洗去乙醇，加入RNase 37℃孵育30 min，PI染色，室温避光固定30 min。流式细胞仪对细胞进行周期测定。

1.2.4 ELISA法检测细胞上清液FN和Ⅳ型胶原在细胞培养48 h末，收集每组细胞上清液，采用酶联免疫法测定FN和Ⅳ型胶原，按试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 统计学处理 计量资料以s表示，应用单因素方差分析进行组间比较。

2 结果

2．1 甘草酸对AGEs诱导HBZY-1细胞增殖的影响 分别以不同浓度的甘草酸（12.5、25、50、100、200、400μmol·L－1）作用于 AGEs诱导的 HBZY-1细胞48 h，MTT法检测各组细胞的增殖。结果显示：在GA为100μmol·L－1时对正常细胞无明显影响，但对AGEs组细胞有抑制作用。作为我们后续实验的浓度。与BSA对照组相比，AGEs组细胞增殖明显增加（P＜0.05），与AGEs组相比，AGEs＋甘草酸组细胞增殖受到抑制且有统计学意义（P＜0.05）。见 Fig 1。

2．2 甘草酸对AGEs诱导HBZY-1细胞周期的影响 流式细胞仪分析显示，与BSA对照组相比，AGEs组细胞S期延长，G1期缩短，且细胞增殖指数PI明显升高（P＜0.05），表明AGEs可刺激HBZY-1的增殖。在药物干预后，甘草酸有增加G1期细胞，降低S期细胞的作用，且PI降低，表明甘草酸可抑制HBZY-1在AGEs刺激下的过度增殖，起到保护HBZY-1的作用。见Fig 2和Tab 1。

Fig 1 Effect of GA on cell proliferation as determ ined by MTT assay*P＜0．05 vs BSA group；＃P＜0．05 vs AGEs group

Tab 1 Effect of GA on the cell cycling phase of HBZY-1 in AGEs medium detected w ith flow cytometric analysis

Tab 1 Effect of GA on the cell cycling phase of HBZY-1 in AGEs medium detected w ith flow cytometric analysis

*P＜0.05 vs BSA group；＃P＜0.05 vs AGEs group

Group G1S PI／%BSA 62.69±4.19 31.48±1.04 35.01±4.21 AGEs 53.81±1.51*38.84±1.94*44.93±0.25*AGEs＋GA 58.79±2.37＃ 34.89±1.13＃ 42.16±1.04＃

Tab 2 Effect of GA on HBZY-1 cell secretion FN and typeⅣcollagen induced by AGEs

2．3 细胞培养上清液中FN和Ⅳ型胶原含量的变化 实验结果表明，正常情况下，体外培养的肾小球系膜细胞具有分泌ECM的功能，但在高糖情况下，系膜细胞分泌FN和Ⅳ型胶原明显升高（P＜0.05）。说明高糖对HBZY-1细胞分泌FN和Ⅳ型胶原有促进作用。甘草酸组FN和Ⅳ型胶原含量有所减少（P＜0.05）。见Tab 2。

3 讨论

肾小球系膜细胞在正常情况下由于有抑制肾小球系膜细胞增殖因子的存在，所以生长和分裂速率很慢［9］。但在病理条件下，生长与抑制失衡，增殖活跃，产生过多的系膜基质，导致系膜硬化，并最终形成肾小球硬化［10］。因此，抑制肾小球系膜细胞的过度增殖一直是防治肾脏纤维化的重要策略之一。

已有证据表明外源性的AGEs可造成实验动物的DN［11］，用AGEs培养肾小球系膜细胞可导致其增殖及产生ECM增加［12］，这说明AGEs可独立于高血糖作用于肾小球系膜细胞诱发DN。

ECM积聚是肾小球疾病发展至肾小球硬化的主要病理改变基础［13］。肾小球的3种固有细胞（内皮细胞、上皮细胞和系膜细胞）均能产生ECM，其中尤以系膜细胞产生能力最强。ECM的大量积聚是肾小球硬化的重要因素，系膜细胞是肾小球内产生ECM的重要来源。正常生理情况下，ECM的合成与降解保持在一种动态平衡之中，但系膜细胞增殖后会打破平衡，导致ECM大量积聚。本实验结果表明，甘草酸能抑制AGEs诱导的HBZY-1细胞的异常增殖，改变细胞周期，降低增殖指数，降低细胞FN和C-Ⅳ的分泌。这说明甘草酸能对抗AGEs对HBZY-1细胞的损伤作用，其可能是通过抑制AGEs诱导细胞的异常增殖来保护细胞免受AGEs的损害。另外，甘草酸能降低ECM中FN和C-Ⅳ的分泌。

Fig 2 Effect of GA on HBZY-1 cell cycle changes induced by AGEsA：BSA group；B：AGEs group；C：AGEs＋GA group

参考文献：

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