江苏单二啤酒大麦麦芽麦汁中混浊物质的研究

张辰东，蔡国林，张 明，陆 健，*

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122;2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122;3.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122;4.宿迁市江南大学产业技术研究院，江苏宿迁223800;5.江苏省农垦麦芽有限公司，江苏射阳224300)

麦芽是生产啤酒的主要原料，麦芽质量的优劣将直接影响啤酒的生产效率和成品啤酒的质量。我国幅员辽阔，东北、西北、江苏等地都是大麦的适产区，但是与此同时，近十年以来，我国年均进口啤酒大麦达170万t，这主要是因为部分国产大麦麦芽的质量存在一些缺陷，不能满足啤酒酿造的需要。

麦汁的即时浊度是指糖化结束、煮沸之前的浊度，以EBC浊度单位表示，是一项评价麦芽质量的重要指标。研究表明引起麦汁混浊的物质主要有蛋白质及β－葡聚糖、阿拉伯木聚糖、糊精等糖类物质。目前，认为引起麦汁、啤酒混浊主要是由于富含脯氨酸的蛋白质易与多酚交联从而形成大分子混浊物质［1］，Siebert的模型描述了啤酒中混浊活性蛋白与混浊活性多酚的结合方式，并解释了两者的相对含量对混浊形成的影响［2］。而对多糖引起麦汁混浊的研究相对较少，Jin采用在麦汁中反添加不同分子量及浓度的β－葡聚糖的方式研究了β－葡聚糖对麦汁浊度的影响，并提出了模型来预测β－葡聚糖浓度及分子量与浊度的关系［3］。此外，大麦及麦芽表面微生物产生的胞外多糖及分泌蛋白等代谢产物，进入麦汁后亦会使浊度升高［4－5］。我国从加拿大、澳大利亚进口的大麦麦芽制备的麦汁通常清亮透明，而江苏啤酒大麦麦芽生产的麦汁浊度较高，且多数伴随着过滤性能差、粘度高等酿造缺陷。这些指标在行业标准中并未体现，因此，大型啤酒厂为了控制原料质量，采购麦芽通常要求其协定麦汁浊度在5.5EBC以下，甚至5.0EBC以下。主要原因是担心引起浊度过高的物质可能会对啤酒生产过程和最终产品的质量产生不利的影响，这导致江苏啤酒大麦麦芽在国内啤酒行业中的使用比例受到了较大的限制。

单二是江苏啤酒大麦典型品种，在江苏啤酒大麦约50万t的年产量中，单二品种占据了40%左右。因此，本文以单二啤酒大麦制备的麦芽为研究对象，采用色谱及质谱等技术，以定量的方式对协定麦汁混浊物质中蛋白质与糖类进行了研究，确定引起麦汁即时浊度升高的物质组成，以期为单二大麦乃至其它品种的改良指明方向，为提高江苏啤酒麦芽质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

商品麦芽 单二麦芽 由江苏省农垦麦芽有限公司提供;Metcalfe麦芽 由中粮麦芽(江阴)有限公司提供。

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、过硫酸铵、考马斯亮蓝 G－250、考马斯亮蓝 R－250等 均为上海生工进口分装产品;其他试剂 均为国产分析纯产品。真菌α－淀粉酶(Fungamyl 800L)、中性蛋白酶(Neatrase 0.8L)为诺维信公司产品;β－葡聚糖酶 为裕立宝公司产品。

WGZ－2－PJ型浊度计 上海昕瑞仪器仪表有限公司;自动糖化仪 轻工部西安轻机所光电公司;麦芽标准粉碎机 北京德之杰啤酒技术有限责任公司;H1850R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;KjeItec2300凯氏定氮仪 瑞典FOSS分析仪器有限公司;Agilent 1100安捷伦液相色谱仪美国安捷伦公司;垂直电泳槽 美国Bio－Rad公司;UV－2100紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;ICS－5000离子交换色谱仪 美国戴安公司;基质辅助激光解析飞行时间串联质谱 德国Bruker公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 麦汁浊度及常规指标的测定 麦汁的制备参照文献［6］采用协定糖化法。浊度的测定采用浊度计，测定原理为90°角散射浊度法［7］，测定在麦汁开始过滤后的30min内完成。麦汁常规指标的测定参照文献［6］。

1.2.2 麦汁混浊物质的收集 取过滤后的麦汁离心，12000r/min 离心(30min，4℃)后，弃去上清，沉淀物质冷冻干燥。

1.2.3 混浊物质的酶解 蛋白酶酶解，取一份协定麦汁(350mL)制备的混浊物质，加3mL蒸馏水及0.1mL蛋白酶，40℃水浴1h后，80℃水浴20min以灭活酶制剂。真菌淀粉酶和β－葡聚糖酶酶解，取一份协定麦汁(350mL)制备的混浊物质，加3mL蒸馏水及0.1mL真菌淀粉酶和0.1mL β－葡聚糖酶，40℃水浴1h后，80℃水浴20min以灭活酶制剂。

1.2.4 糖化过程添加酶制剂实验 蛋白酶添加实验，在单二麦芽协定糖化起始阶段添加0.1mL蛋白酶;真菌淀粉酶和β－葡聚糖酶添加实验，在单二麦芽协定糖化起始阶段添加0.1mL真菌淀粉酶和0.1mL β－葡聚糖酶。糖化结束后，测定麦汁浊度。

1.2.5 麦芽蛋白的提取 取细粉的麦芽粉0.1g，加1mL蒸馏水，60℃水浴提取1h，期间每隔15min混匀数次，离心取上清液，作为水溶蛋白(清蛋白);在沉淀中再添加5%(W/V)NaCl溶液1mL，重复提取过程，上清液为盐溶蛋白(球蛋白);在沉淀中再添加70%乙醇溶液1mL，重复提取过程，离心取上清液，作为醇溶蛋白［8］。

1.2.6 蛋白质含量的测定 取冻干后的沉淀物质，参照文献［9］测定。

1.2.7 氨基酸组成分析 冻干物用6mol/L盐酸在110℃真空条件下水解22h，水解液过滤、离心，用高效液相色谱法测定氨基酸含量［10］。

1.2.8 SDS－PAGE电泳 采用单向垂直电泳系统，分离胶为12.5%丙烯酰胺，浓缩胶为5%。样品为少量冻干沉淀物质溶于8mol/L尿素(含有1%(W/V)SDS、1%(V/V)β－巯基乙醇)中。蛋白质含量的测定采用 Bradford 法［11］，A、B、C、D 泳道上样量分别为10、15、15、20μL。

1.2.9 MALDI－TOF/TOF鉴定 切取SDS－PAGE电泳胶上的目标条带，经过胰蛋白酶消化之后，通过飞行时间串联质谱分析和蛋白质数据库(NCBInr)检索(http://www.matrixscience.com/)进行蛋白质鉴定。

1.2.10 总糖含量测定 将少量冻干样品分散于蒸馏水中，采用苯酚－硫酸法测定总糖含量［12］。

1.2.11 总多酚含量测定 将少量冻干样品分散于蒸馏水中，采用Folin－Ciocalteu法测定总多酚含量［13］。

1.2.12 高效阴离子交换色谱－脉冲安培检测(HPAEC－PAD)分析多糖水解后单糖组成 多糖的水解采用 Krahl等人(2009)的方法［14］，取少量冻干物质，加4mL蒸馏水和4mL 4mol/L HCl，于沸水浴中水解1h，冷却至室温后加4mL 4mol/L NaOH中和，离心，过0.45μm滤膜，用高效阴离子交换色谱分析单糖含量。色谱柱:CarboPac PA20;检测器:脉冲安培检测器;流动相 A:水;流动相 B:250mmol/L NaOH;流动相 C:1mol/L NaAc;流速:0.5mL/min;梯度洗脱条件:0～21.1min，98.2%A、1.8%B;21.1～30min，93.2%A、1.8%B、5%C;30～30.1min，78.2%A、1.8%B、20%C;30.1～50min，20%A、80%B。

表1 不同品种麦芽常规指标及协定麦汁浊度比较Table 1 Comparison of malt quality parameters and Congress wort turbidity between Daner and Metcalfe malt

表2 混浊物质基本成分Table 2 Basic ingredient of the turbid substances

1.2.13 数据分析 所有实验数据均测定3次，取其平均值。运用SPSS 11.5软件进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 不同品种大麦麦芽麦汁浊度比较

啤酒行业普遍采用协定麦汁指标评价麦芽的品质。单二与Metcalfe协定麦汁指标如表1所示，可以看出Metcalfe麦芽的质量明显优于单二麦芽，单二麦汁的浊度比 Metcalfe麦汁高 7.82EBC，粘度比Metcalfe麦汁高0.21mPa·s，而30min的过滤体积仅为130mL，不到Metcalfe麦汁的50%。在江苏啤酒大麦麦芽中，协定麦汁即时浊度高、粘度大与过滤性能差通常同时出现，而混浊物质可能是导致滤层堵塞，引起过滤速度减慢的物质基础，因此有必要对引起麦汁即时浊度升高的混浊物质进行解析。

2.2 混浊物质主要成分分析及其对麦汁浊度的影响

通过离心收集单二麦汁的混浊物质，经冷冻干燥后，对制备的混浊物质的基本成分分析如表2所示，可以看出麦汁混浊物质主要成分为多糖，其次为蛋白质、多酚，三种物质总量为98.87%。以往对于麦汁混浊物质的研究，主要以显微染色及反添加的方式定性描述，而本研究首次通过离心得到混浊物质，采用定量分析的方式，全面、真实地描述了麦汁混浊物质。在江苏麦芽麦汁中，陈继超［15］通过反添加各种物质的方式发现影响麦汁浊度的物质主要为高分子和中分子蛋白，然而由于反添加物质的结构及分子量与麦汁内源性混浊物质有差异，因此并不能真实地反映出麦汁混浊物质的组成情况。

为进一步验证多糖引起混浊的能力，对混浊物质采用不同的酶制剂进行酶解处理，将处理后的混浊物质反添加到协定糖化结束前20min的麦汁中，同时以不作处理的混浊物质作为对照，引起麦汁浊度变化的情况如表3所示。可以看出反添加混浊物质后，单二及Metcalfe麦汁浊度分别升高3.44EBC及2.92EBC，使用蛋白酶对混浊物质酶解后并反添加，单二及Metcalfe麦汁浊度分别升高2.98EBC及2.57EBC，使用真菌淀粉酶和β－葡聚糖酶处理后并反添加，单二及Metcalfe麦汁浊度分别升高0.33EBC及0.30EBC。因此，认为引起单二协定麦汁混浊的主要物质为多糖。

表3 酶解混浊物质对麦汁浊度的影响Table 3 Effect of turbid substances hydrolysed by enzyme on wort turbidity

糖化初始阶段添加酶制剂对麦汁浊度的影响如图1所示。可以看出，蛋白酶及真菌淀粉酶和β－葡聚糖酶都有降低麦汁浊度的作用，加入蛋白酶后，麦汁浊度从对照的9.00EBC降低到8.33EBC，加入真菌淀粉酶和 β－葡聚糖酶后，麦汁浊度从对照的9.00EBC降低到4.57EBC。由此进一步证明，多糖为引起单二麦汁混浊的主要物质。

2.3 多糖的单糖组成分析

多糖的单糖组成分析结果如表4所示，可以看出，冻干物质水解后的单糖主要为葡萄糖，其次为半乳糖、阿拉伯糖、木糖，此外还有少量的鼠李糖及氨基糖。根据麦汁混浊物质的组成情况分析，葡萄糖主要来源于未降解的β－葡聚糖或糊精;阿拉伯木聚糖含量可根据Schwarz提出的公式:阿拉伯木聚糖(AX)=(阿拉伯糖(arabinose)+木糖(xylose))×0.88［16］计算得到，含量为 1.19%(W/W);阿拉伯半乳聚糖肽(AGP)含量为半乳糖的1.516倍［14］，为5.31%(W/W)。通常认为β－葡聚糖与阿拉伯木聚糖对麦汁的粘度影响很大，而这些聚糖物质在浓度较高时，会交联形成网状结构，进而形成高粘度凝胶，与蛋白、多酚及其它多糖结合形成复杂的混浊物质［17］。阿拉伯半乳聚糖肽是一种非交联、多分散的大分子物质，在水溶液中只表现出轻微的非理想效应［18］。

表4 混浊物质中单糖组成Table 4 Monosaccharide composition of the turbid substances

图1 协定糖化添加酶制剂对单二麦汁浊度的影响Fig.1 Effect of enzyme on Daner wort turbidity in Congress Mashing

2.4 蛋白质组分分析

2.4.1 SDS－PAGE电泳 混浊蛋白的SDS－PAGE电泳图谱如图2所示，可以看出麦汁中混浊蛋白包括多个条带，蛋白分子量主要分布于25～45ku及小于18.4ku两个部分，这与文献报道的啤酒混浊蛋白的分子量分布较为一致［8］。蛋白来源方面，从图2可以看出麦汁混浊蛋白主要来自于麦芽水溶蛋白及醇溶蛋白，其中条带1和5在麦芽蛋白中没有明显对应条带，可能是由于麦芽蛋白提取方法的限制所致，条带2和4在麦芽醇溶蛋白中有对应条带，条带3和6在麦芽水溶及盐溶蛋白中有对应条带，表明这部分蛋白可以抵抗糖化过程中的酶解作用及热变性，进而出现在过滤后的麦汁中。

2.4.2 混浊蛋白的质谱分析 混浊蛋白的SDSPAGE条带经胰蛋白酶消化、质谱分析的结果如表5所示，可以看出，混浊蛋白中的条带1与条带2都鉴定为AMY2/BASI复合体A链，BASI来源于大麦，是一种大麦α－淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂，它能够与大麦 α－淀粉酶同工酶2(AMY2)结合形成AMY2/BASI复合体，这是一种蛋白质－蛋白质的复合体，通常认为该复合体与调节大麦中淀粉降解有关［19］。条带1与条带2分子量相差较大，鉴定为同一蛋白，这可能是由于AMY2与BASI结合为蛋白复合体，并相互交联从而形成了分子量较大的物质，而在SDS－PAGE电泳时又没有打开交联，从而出现在了电泳图谱中。同时由于质谱鉴定是以匹配的氨基酸序列为依据，因此条带1同样鉴定为AMY2/BASI复合体A链。

图2 混浊蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE of wort haze proteins

条带3鉴定为Z4蛋白。Z蛋白属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，有Z4蛋白与Z7蛋白两种。Z蛋白与β－淀粉酶在某种程度上具有一定的联系，是一种富含赖氨酸的蛋白质，其在制麦及糖化过程中能够抵抗变性及蛋白酶的水解作用，继而出现在麦汁中，形成混浊物质［20］。条带4鉴定为大麦醇溶蛋白γ3。大麦醇溶蛋白是一种富含脯氨酸的蛋白质，根据分子量、硫含量及氨基酸组成的差异，可分为B、C、D及γ四种。金蓓等研究认为与胰蛋白酶抑制剂 CMe、germin E及Z蛋白相比，大麦醇溶蛋白γ3是一种次要的混浊活性蛋白，但是在形成混浊的过程中依然具有关键性作用［8，21］。条带5鉴定为油体钙蛋白2，这是一种与油脂代谢有关的蛋白，如参与膜融合和脂肪体融合等过程，同时有文献指出油体钙蛋白可能具有一种利于蛋白质相互结合的独特表面［22］，这可能与混浊的形成有关。条带6鉴定为BTI－CMe2.1，是一种氯仿/甲醇可溶蛋白(CM蛋白)，属于胰蛋白酶/α－淀粉酶抑制剂属，通常分子量较低，在9～16ku之间，且脯氨酸含量较低，在8%左右。这些疏水蛋白或其片段在制麦及糖化过程中能够抵抗蛋白酶的水解作用而出现在麦汁中，进而形成混浊物质［23］。

表5 混浊蛋白的质谱鉴定结果Table 5 Haze protein identified by mass spectrometry

2.4.3 氨基酸含量分析 混浊蛋白的氨基酸分析结果如表6所示，可以看出麦汁混浊蛋白的氨基酸组成具有一定的特异性，以谷氨酸、天冬氨酸及脯氨酸居多。谷氨酸及脯氨酸通常认为是啤酒混浊蛋白的主要氨基酸［1］，而在麦汁混浊蛋白中这两种氨基酸的含量很丰富，也证实了啤酒混浊蛋白与麦汁混浊蛋白的同源性;麦芽 α－淀粉酶中富含天冬氨酸［24－25］，这与麦汁混浊蛋白中天冬氨酸含量丰富相吻合。

表6 混浊物质中17种氨基酸含量Table 6 Amino acid content of the turbid substances

3 结论

采用SDS－PAGE电泳结合质谱分析、离子交换色谱技术研究了单二麦汁混浊物质中的蛋白质及糖类物质，结果表明:a.引起江苏单二啤酒大麦麦芽协定麦汁混浊的关键性物质为多糖。b.组成混浊多糖的单糖以葡萄糖为主，其次为半乳糖、阿拉伯糖、木糖。c.混浊蛋白研究方面，SDS－PAGE电泳表明混浊物质中蛋白质分子量主要集中于25～45ku及小于18.4ku的两个部分，质谱分析表明混浊蛋白主要为AMY2/BASI复合体A链，此外还有少量的Z4蛋白、大麦醇溶蛋白γ3、油体钙蛋白2及BTI－CMe2.1。氨基酸组成以谷氨酸、天冬氨酸及脯氨酸居多。后续将对多糖的结构及其与蛋白质是否存在交联特性等进行研究，以进一步明确多糖引起麦汁混浊的原因。本研究明确了单二麦芽协定麦汁中的混浊成分，对提高麦芽品质、改良大麦品种具有借鉴意义。

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