慢性间歇性低压低氧增强丹皮酚舒张大鼠动脉的作用

郭 赞，宋士军，宋 爽，马 坤，于 雷，宋彦丽，马会杰，张 翼

（河北医科大学1.生理学教研室、2.2008级临床医学专业，河北 石家庄 050017）

丹皮酚（paeonol，Pae），又称牡丹酚，主要是从常用中药徐长卿、牡丹和芍药中提取的活性成分。现已发现，丹皮酚具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤和抗菌作用，对脑缺血损伤有保护作用［1］。关于丹皮酚对血管功能的影响报道甚少，曾有报道，丹皮酚能够舒张大鼠离体胸主动脉环［2］，丹皮水煎液静脉注射使麻醉犬的血压下降［3］。

大量研究表明，慢性间歇性低压低氧（chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH）可增强机体对缺血、缺氧耐受性，对心脏、神经、肝脏等器官组织发挥保护作用［4－5］。也有研究表明，CIHH对动物血压具有调节作用，可明显降低原发性高血压病人及自发性高血压大鼠的动脉血压［6］。我们以往研究显示，CIHH处理可非内皮依赖性地降低大鼠胸主动脉对ANGⅡ诱发的收缩反应［7］，此作用可能参与CIHH的降压作用。此外，我们研究也发现，CIHH可增强心脏对Anandamide的反应性。但CIHH对丹皮酚舒血管作用的影响，尚未见报道。

本研究以大鼠离体胸主动脉为研究对象，探讨CIHH对丹皮酚舒张血管作用的影响，并探讨其作用机制，为丹皮酚在缺氧环境下的临床应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 药品及仪器 丹皮酚购自Alfa Aesar公司；去甲肾上腺素（NE）、心得安（propranolol）、乙酰胆碱（acetylcholine）、格列苯脲（glibenclamide）、左旋硝基精氨酸甲酯 （NG-nitro-L-arginine methylester，LNAME）购自 Sigma公司；吲哚美辛（indomethacin，Indo）购自 Calbiochem公司。其余为市售药品。Krebs液（mmol·L－1）：氯化钠 118、氯化钾 4.7、氯化钙2.52、硫酸镁·7H2O 1.2、碳酸氢钠24.2、磷酸二氢钾1.18、葡萄糖11.0，调至 pH（7.4±0.05）。无钙Krebs液为不加氯化钙，其余相同。

SQG-4四腔器官浴槽系统（成都仪器厂生产）；HSS-1型恒温浴槽（成都仪器厂生产）；BL-420E＋生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司生产）。

1.2 实验动物和间歇性低压低氧处理 ♂成年Sprague-Dawlay（SD）大鼠46只，每只大鼠可取得6～8个动脉环，每组动物中的每个动脉环均来自不同的大鼠，清洁级，体质量250～300 g，由本校实验动物中心提供，合格证号：1001002，许可证号：CXK（冀）2008-1-003。CIHH组动物置于低压氧舱接受28 d模拟5 000米海拔高度的低压低氧（PB＝53.87kPa，PO2＝11.2 kPa，11.1%O2）处理，每天6 h，自由食水。正常氧组动物除不接受慢性低压低氧处理之外，其余与CIHH组动物相同。

1.3 大鼠离体胸主动脉环制备和收缩活动的记录方法 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50μg·g－1）麻醉，迅速开胸，取胸主动脉，置于盛有Krebs液的培养皿内，分离血管周围组织，剪成长约3 mm的动脉环。实验前，用 NE 0.62μmol·L－1检测离体胸主动脉环的活性，选择经 NE 0.62μmol·L－1处理后收缩的离体胸主动脉环；稳定2 h后，换液3次，开始实验。去内皮方法和检测：用粗细合适的金属丝从血管腔通过，以去除血管内皮细胞，选择NE 0.62 μmol·L－1预收缩后对 ACh 1.0μmol·L－1诱发的舒张反应大于70%，认为血管内皮完整，不引起舒张反应的标本作为去内皮。

直径约0.1 mm的不锈钢丝小心穿入离体主动脉环，制成三角环状，随后置于盛有5 ml Krebs液的浴槽内，持续通入95%O2和5%CO2混合气。静息张力为1 g。离体主动脉环通过不锈钢丝和细线与张力换能器连接，分别接入1、2、3和4通道。用BL-420E＋生物机能实验系统记录张力。

1.4 CIHH处理后，丹皮酚对大鼠离体胸主动脉环收缩活动的影响

1.4.1 CIHH处理后，丹皮酚对NE诱发的大鼠离体胸主动脉环收缩活动的影响 将CIHH和正常氧大鼠各分为3组，每组均为8例。NE组：加入NE 0.62μmol·L－1，10 min后，加入等容量 Krebs液；NE＋丹皮酚组：加入 NE 0.62μmol·L－1，10 min后，累积加入丹皮酚，使其终浓度分别为10、20、40、80、160、320 mg·L－1，加药间隔为 5 min；去内皮 ＋NE＋丹皮酚组：将血管去内皮，其余同NE＋丹皮酚组。记录张力的变化。

1.4.2 CIHH处理后，丹皮酚对KCl诱发的大鼠离体胸主动脉环收缩活动的影响 将CIHH和正常氧大鼠各分为3组，每组均为8例。KCl组：加入KCl 20 mmol·L－1，10 min后，加入等容量 Krebs液；KCl＋丹皮酚组：加入 KCl 20 mmol·L－1，10 min后，累积加入丹皮酚，使其终浓度分别为10、20、40、80、160、320 mg·L－1，加药间隔为 5 min；去内皮 ＋KCl＋丹皮酚组：将血管去内皮，其余同KCl＋丹皮酚组。记录张力的变化。

1.4.3 CIHH处理后，心得安、L-NAME、格列苯脲和吲哚美辛对丹皮酚舒张大鼠离体胸主动脉环作用的影响 将CIHH和正常氧大鼠各分为5组，每组均为8例，即：蒸馏水＋NE＋丹皮酚组、心得安＋NE＋丹皮酚组、L-NAME＋NE＋丹皮酚组、格列苯脲＋NE＋丹皮酚组和吲哚美辛＋NE＋丹皮酚组。各组分别加入蒸馏水、心得安 10μmol·L－1、LNAME 0.3 mmol·L－1、格列苯脲 5μmol·L－1和吲哚美辛10μmol·L－1，10 min后加入 NE 0.62μmol·L－1，作用 10 min后，加入丹皮酚 80 mg·L－1，记录张力的变化。

1.4.4 CIHH处理后，丹皮酚对NE诱发的大鼠胸主动脉环两种收缩反应的影响 将CIHH和正常氧大鼠各分为对照组和丹皮酚组，每组均为8例。将胸主动脉环在Krebs液中温浴，待收缩张力稳定后20 min，换无钙 Krebs液温浴，20 min后加入 NE 0.62μmol·L－1可引起收缩反应，此时引起的收缩为NE在无钙液中促使细胞内钙释放所致；待收缩张力达最大值并稳定时，加入氯化钙2.49 mmol·L－1，以恢复正常Krebs液中的钙浓度，出现进一步收缩反应，这是NE作用下促使细胞外钙进入细胞内所致。用Krebs液冲洗3次后，再置入Krebs液中温浴20 min，换无钙Krebs液温浴，丹皮酚组此时加入丹皮酚80 mg·L－1，对照组则加入等容量Krebs液；20 min后重复加入NE和氯化钙，观察两种收缩反应张力。并分别计算第2次占第1次收缩张力的百分比。

1.5 统计学方法 所有数据均用¯x±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步组间比较选用SNK多重比较检验或Dunnett-t检验，显著性水准取α＝0.05。以给药前NE或KCl引起的血管最大收缩张力为100%，计算给药后5 min的收缩张力占最大收缩张力的百分数。半数抑制浓度（inhibitory concentration at 50%，IC50）的计算用Logit法。

Fig 1 Effects of paeonol on contractive activity induced by NE of isolated rat aorta rings after CIHH±s，n＝8）NE：Norepinephrine；Pae：Paeonol；Normal：Normal oxygen；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia；WE：Whip off endothelium.*P＜0.05 vs CIHH＋NE group（B），by F test and SNK test；*P＜0.05 vs NE group（C），by F test and SNK test；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Normal＋NE＋Pae group（D），by t test.

2 结果

2.1 CIHH处理后，丹皮酚对NE诱发的大鼠离体胸主动脉环收缩活动的影响 CIHH组加入NE后，引起收缩的张力各时间点与正常氧组之间相比，经t检验差异均无显著性（P＞0.05，Fig 1A），说明CIHH处理对NE引起的大鼠动脉环收缩反应无明显影响。

在CIHH和正常氧大鼠，丹皮酚均使血管明显舒张，IC50分别为51.56和 139.05 mg·L－1；经单因素方差分析和进一步SNK多重比较检验，NE＋丹皮酚组和去内皮＋NE＋丹皮酚组对NE诱发的主动脉收缩均有明显对抗作用，CIHH和正常氧大鼠在丹皮酚剂量为20～320 mg·L－1时，与相应的NE组相比，差异有显著性（P＜0.05，Fig 1B、C），但去内皮＋NE＋丹皮酚组与相应的NE＋丹皮酚组相比，差异均无显著性，说明其作用均为非内皮依赖性的（P＞0.05，Fig1B、C）。

丹皮酚对CIHH大鼠的舒血管作用更为明显，其NE＋丹皮酚组与正常氧大鼠比较，经t检验，当给药浓度为20～320 mg·L－1时，两组均值间差异有显著性（P＜0.05，Fig 1D）。

2.2 CIHH处理后，丹皮酚对KCl诱发的大鼠离体胸主动脉环收缩活动的影响 CIHH组加入KCl后，引起收缩的张力各时间点与正常氧组之间相比，经t检验差异均无显著性（P＞0.05，Fig 2A），说明CIHH处理对KCl引起的大鼠动脉环收缩反应无明显影响。

在CIHH和正常氧大鼠，丹皮酚均使血管明显舒张，IC50分别为72.44和 195.24 mg·L－1；经单因素方差分析和进一步SNK多重比较检验，CIHH和正常氧大鼠的KCl＋丹皮酚组和去内皮＋KCl＋丹皮酚组对KCl诱发的主动脉收缩均有明显对抗作用，两组在丹皮酚剂量为10～320 mg·L－1时与相应的KCl组相比，差异有显著性（P＜0.05，Fig 2B、C），但去内皮＋KCl＋丹皮酚组与相应的KCl＋丹皮酚组相比，差异均无显著性，说明其作用均为非内皮依赖性的（P＞0.05，Fig 2B、C）。

丹皮酚对CIHH大鼠的舒血管作用更为明显，其KCl＋丹皮酚组与正常氧大鼠比较，经t检验，当给药浓度为80～320 mg·L－1时，两组均值间差异有显著性（P＜0.05，Fig 2D）。

2.3 CIHH处理后，心得安、L-NAME、格列苯脲和吲哚美辛对丹皮酚舒张大鼠离体胸主动脉环作用的影响 经单因素方差分析和进一步Dunnett-t检验，在CIHH和正常氧大鼠，心得安和L-NAME均明显对抗了丹皮酚的舒血管效应，心得安＋NE＋丹皮酚组和L-NAME＋NE＋丹皮酚组收缩张力与蒸馏水＋NE＋丹皮酚组之间相比，差异有显著性（P＜0.05，Tab 1）；格列苯脲只对抗了CIHH大鼠丹皮酚的舒血管效应，在CIHH大鼠，格列苯脲＋NE＋丹皮酚组收缩张力与蒸馏水＋NE＋丹皮酚组之间相比差异有显著性（P＜0.05，Tab 1）；在CIHH和正常氧大鼠，吲哚美辛＋NE＋丹皮酚组与蒸馏水＋NE＋丹皮酚组相比较，差异均无显著性（P＞0.05，Tab 1）。

2.4 CIHH处理后，丹皮酚对NE诱发的大鼠胸主动脉环两种收缩反应的影响 CIHH大鼠：丹皮酚组NE引起的细胞内钙和细胞外钙收缩张力明显降低，与对照组相比差异均有显著性（P＜0.01，Tab 2）。

正常氧大鼠：丹皮酚组NE引起的细胞外钙收缩张力明显降低，与对照组相比，差异有显著性（P＜0.01，Tab 2）；丹皮酚组与对照组相比，NE引起的细胞内钙收缩张力之间差异没有显著性（P＞0.05，Tab 2）。

Fig 2 Effects of paeonol on contractive activity induced by KCl of isolated rat aorta rings after CIHH±s，n＝8）Pae：Paeonol；Normal：Normal oxygen；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia；WE：Whip off endothelium.*P＜0.05 vs CIHH＋KCl group（B），by F test and SNK test；*P＜0.05 vs KCl group（C），by F test and SNK test；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Normal＋KCl＋Pae group（D），by t test.

Tab 1 Effects of propranolol，L-NAME，glibenclamide and indomethacin on vasodilative effects of paeonol on isolated thoracic aorta rings after CIHH（x¯±s，n＝8）

Tab 1 Effects of propranolol，L-NAME，glibenclamide and indomethacin on vasodilative effects of paeonol on isolated thoracic aorta rings after CIHH（x¯±s，n＝8）

Paeonol：80 mg·L－1；NE：Norepinephrine；L-NAME：NG-nitro-L-arginine methylester；Normal：Normal oxygen；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia.*P＜0.05 vs H2 O＋NE＋Paeonol group，by F test and Dunnett-t test.

Group CIHH Normal H2 O＋NE＋Paeonol 9.71 39.80±9.89 52.80±10.2 Propranolol＋NE＋Paeonol 79.78±13.39*75.65±11.26*L-NAME＋NE＋Paeonol 65.95±12.10*74.00±11.30*Glibenclamide＋NE＋Paeonol 59.19±12.66*58.06±9.78 Indomethacin＋NE＋Paeonol 45.49±9.86 56.44±

Tab 2 Effects of paeonol on NE-induced intracellular and extracellular calcium-dependent contraction in isolated thoracic aorta rings after CIHH（±s，n＝8）

Tab 2 Effects of paeonol on NE-induced intracellular and extracellular calcium-dependent contraction in isolated thoracic aorta rings after CIHH（±s，n＝8）

Paeonol：80 mg·L－1；CIHH：Chronic intermittent hypobaric hypoxia；Intra-Ca2＋contraction：NE-induced intracellular calcium-dependent contraction；Extra-Ca2＋contraction：NE-induced extracellular calcium-dependent contraction.**P＜0.01 vs control group，by t test.

CIHH Normal oxygen Control Paeonol Intra-Ca2＋contraction 100.66±20.43 69.71±14.51**Control Paeonol 99.73±21.02 91.97±15.54 Extra-Ca2＋contraction 99.84±20.24 52.24±11.04**98.55±20.91 64.28±12.80**

3 讨论

CIHH作为增强机体、组织对缺氧耐受性的手段已被广泛应用［8］。本研究表明，CIHH处理对大鼠离体动脉舒缩活动没有明显影响，其主要影响显示在对药物的反应上，CIHH明显增强了丹皮酚的舒张血管效应，推测其机制可能是增强了与正常氧相同的作用途径。除此以外，还通过激活ATP敏感性K＋通道和抑制内钙释放而发挥作用。

以往的研究表明，CIHH可以降低血压［6］，推测CIHH可能造成心血管系统的功能和调节机制出现变化，包括对体液因素和药物作用的反应发生改变。血管平滑肌细胞膜上的Ca2＋通道至少有两种，电压控制性 Ca2＋通道（voltage dependent Ca2＋channel，VDCC）和受体控制性 Ca2＋通道（receptor operated Ca2＋channel，ROCC）［9］。KCl使细胞膜去极化，主要打开VDCC，而加入NE主要打开ROCC［7］。本实验中CIHH处理后，丹皮酚对KCl和NE诱发的大鼠离体胸主动脉环的收缩均有明显的舒张作用，说明CIHH处理后，丹皮酚的舒血管作用既可以通过阻断VDCC，也可以通过阻断ROCC及相关途径，其作用是直接作用，不依赖内皮。这在作用途径上与正常氧动物是一致的，但是，CIHH明显增强了丹皮酚舒张大鼠离体血管的作用，可能是因为CIHH使丹皮酚对VDCC和ROCC的阻断程度更强。

β受体激动可使血管平滑肌舒张，心得安可以阻断β受体［10］。本实验中CIHH处理后，心得安部分阻断了丹皮酚对大鼠血管平滑肌的舒张作用，推测丹皮酚的作用可能与激动β受体有关。L-NAME是NO合酶抑制剂，可以降低组织中NO的浓度。有研究表明，内皮细胞通过释放NO，激活血管平滑肌细胞的鸟苷酸环化酶，引起环磷酸鸟苷（cGMP）升高，最终使血管舒张［11］。本实验中 CIHH处理后，L-NAME部分阻断了丹皮酚舒张大鼠血管平滑肌的作用，说明丹皮酚对血管的舒张作用可能与其使NO浓度增加有关。以上CIHH处理后，丹皮酚的激动β受体和使NO浓度增加的作用与正常氧动物在作用途径上没有区别，推测是作用程度上的不同。

平滑肌上存在ATP敏感型K＋通道，其激活可以使K＋外流增多，膜超极化平滑肌舒张［12］。格列苯脲是ATP敏感型K＋通道的阻断剂，本实验中CIHH处理后，格列苯脲部分阻断了丹皮酚舒张大鼠血管的作用，而对正常氧大鼠无阻断作用。推测与CIHH处理后，ATP敏感型K＋通道对丹皮酚的敏感性提高有关。

前列腺素族的前体花生四烯酸在环氧合酶等的作用下，可以形成前列环素（PGI2）等舒张血管的［13］物质，以及前列腺素H2和血栓烷A2等收缩血管的物质。丹皮酚舒张CIHH和正常氧大鼠血管的作用未被吲哚美辛阻断，提示丹皮酚的作用与前列腺素类物质无关。

NE可以激动肾上腺素能受体，通过酪氨酸激酶信号途径促进内钙释放和外钙内流［14］，但在无钙营养液中，NE可迅速诱发血管收缩的作用是促进细胞内钙释放所致。本实验中CIHH处理后，丹皮酚明显抑制了NE诱发的细胞内钙和外钙性收缩，而在正常氧动物，丹皮酚未抑制细胞内钙性收缩。已有的研究表明，CIHH在某些病理状态发挥保护作用，其机制可能与CIHH可改变某些通道的基因表达、蛋白的表达及通道的功能有关［15－18］。基于此，我们推测，CIHH处理后，可能改变了某些通道的数目或功能状态，使丹皮酚对内钙的释放发挥了抑制作用，当然，这些尚待进一步深入研究。

本实验提示，CIHH可以从受体、通道和离子释放等方面影响药物的作用，影响药物原有的作用机制或通过新的作用途径发挥作用，临床治疗时应该考虑缺氧对药物作用的影响。

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