黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制*

郭维文，黎帅，陈玲玲，陆文松，李佑生△

(1暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院中医科，广东深圳 518020;2暨南大学医学院中医学系，广东广州 510632)

黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制*

郭维文1，2，黎帅2，陈玲玲1，2，陆文松1，2，李佑生1△

(1暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院中医科，广东深圳 518020;2暨南大学医学院中医学系，广东广州 510632)

目的:观察黄芪甲苷(AS-IV)对糖尿病肾病(DN)肾脏的保护作用及其机制。方法：38只清洁级雄性SD大鼠分成正常组(10只)、模型组(14只)和AS-IV干预组(14只)，用链脲佐菌素造模，成功后1周开始治疗，期间每4周动态观测血糖及尿微量白蛋白，治疗12周后处死大鼠取材及采血，取肾皮质行HE和Masson染色观察，并检测β1整合素、整合素连接激酶(ILK)和α-actinin-4的蛋白表达水平。结果:干预8周末AS-IV组血糖水平较模型组明显降低(P＜0.01)。干预12周末AS-IV组与模型组相比，尿微量白蛋白明显下降(P＜0.01)，并使因造模引起的β1整合素、ILK和α-actinin-4表达水平的变化产生逆变(P＜0.05)。与正常组比较，模型组的β1整合素、ILK和α-actinin-4表达水平均有明显差异(P＜0.05)。结论:AS-IV对DN肾脏有明显保护作用，能降低血糖和尿白蛋白排泄量，改善足细胞黏附功能，从而延缓DN的进展。

黄芪甲苷;糖尿病肾病;足细胞;蛋白尿

研究表明糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)患者尿中丢失的足细胞数和尿蛋白量呈正相关［1-2］。2型糖尿病患者有微量白蛋白尿者，50%可以检测出尿中有足细胞，已经出现明显蛋白尿者，这一比例达到80%［3］，提示足细胞对肾小球基底膜的黏附失常与脱落，是DN蛋白尿发生的主要原因之一。有人发现［4］从肾小球基底膜脱落至尿液中的足细胞部分具有活力，说明足细胞的脱失较凋亡在DN蛋白的发病中发挥了更为重要的作用。本研究通过黄芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)对DN进行干预，探讨其对DN病变时血糖、蛋白尿和足细胞黏附功能及分子机制的影响。

材料和方法

1 材料

1.1 动物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠38只(SPF级)，8周龄，体重为(200±20)g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号为0010232。于暨南大学医学院动物实验中心适应性饲养7 d，测空腹血糖低于7 mmol/L。

1.2 药品黄芪甲苷(98%干粉)购自成都锦泰和医药化学技术有限公司。链脲佐菌素(98%干粉)购自Sigma。

1.3 仪器血糖仪为罗氏(Roche)产品;7020全自动生化分析仪为日立股份有限公司产品。

2 方法

2.1 分组、模型制作与给药方法按数字随机表法，将SD大鼠分成3组:正常组(10只)、模型组(14只)和AS-IV干预组(14只)。根据文献［5］的方法，经12 h禁食后(不禁水)，左下腹腔注射链脲佐菌素。72 h后，连续3 d取尾静脉血测血糖，以连续3次血糖＞16.7 mmo/L作为糖尿病模型大鼠。干预组给予AS-IV 40 mg·kg-1·d-1;而正常组、模型组给予等量生理盐水，均每天灌胃1次。不使用胰岛素及其它降糖药物。药物干预期间除正常组大鼠外，其余各组均有死亡，其中模型组6只死亡，AS-IV 组4只死亡。

2.2 检测指标(1)血、尿指标:剪尾采血用血糖仪测定24 h尿微量白蛋白。(2)组织病理染色观察:对肾皮质行HE、Masson染色，观察肾小球系膜及系膜基质的情况，选取10个肾小球计算面积比并取平均值进行统计学分析。(3)免疫组织化学分析:对肾皮质预处理后对β1整合素、α-actinin-4和整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)指标行免疫组织化学法染色，随机选择10个肾小球照相，测量平均积分吸光度(IA)，然后计算3张图片IA值的平均值，以此反映该只实验大鼠免疫组化反应物(蛋白)表达的强度。

3 统计学处理

计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0统计软件分析，组间比较用单因素方差分析，不同时点所获数据采用重复测量数据行方差分析，LSD法对方差分析有统计学意义的资料进行各组间的两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 黄芪甲苷对血糖和尿蛋白的改善作用

用药8周末时，AS-IV组血糖水平较模型组明显降低(P＜0.05)，12周末时AS-IV组尿微量白蛋白较模型组明显减少(P＜0.01)，差异有统计学意义，见表1、2。

表1 AS-IV在不同时点对糖尿病肾病大鼠血糖水平的影响Table 1.Glucose level at different time points(mmol/L.Mean±SD)

表2 AS-IV在不同时点对糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白水平的影响Table 2.The excretion of 24 h urinary microalbumin at different time points(μg/24 h.Mean±SD)

2 黄芪甲苷对肾脏组织病理学的影响

模型组的系膜细胞、系膜基质等肾小球固有成分明显增生，基底膜明显增厚，与正常组、AS-IV组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图1、表3。

Figure 1.Pathological observation of antagonism of AS-IV on renal injury in diabetic nephropathy rats(×400).图1 AS-IV拮抗大鼠糖尿病肾病肾脏损伤的病理形态学观察

表3 AS-IV对糖尿病肾病大鼠基底膜面积比与肾小球固有成分比值的影响Table 3.The area proportions of glomerular basement membrane (SGBM)and intrinsic composition(SIC)in different groups(%.Mean±SD)

3 黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠足细胞黏附分子和骨架蛋白的影响

模型组和干预组与正常组比较，β1整合素表达水平均明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。干预组与模型组比较，β1整合素表达水平有所增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组、AS-IV组与正常组比较，ILK和α-actinin-4表达水平均有增高，差异均有统计学意义(P＜0.01)。干预组与模型组比较，ILK和α-actinin-4的表达水平均有降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图2、表4。

Figure 2.Immunohistochemical staining of α-actin in-4 and ILK in the podocytes of rats(×400).图2 大鼠足细胞α-actin in-4和ILK的免疫组化染色

表4 AS-IV对糖尿病肾病大鼠β1整合素、ILK和α-actin-4表达水平的影响Table 4.Expression level of β1integrin，ILK and α-actinin-4 in different groups examined by immunohistochemistry (Mean±SD)

讨论

糖尿病肾病是糖尿病的主要微血管并发症之一，是造成终末期肾衰竭的主要因素之一，是中老年人常见的疾病之一。糖尿病早期于影像学上无明显改变，随着病情的进展可出现肾脏的增大，早期病理解剖可发现肾脏细胞的增生和肥大，并且这种病理改变很大可能是相继发生。由于糖尿病肾脏组织中不同类型细胞的生长及生长速度反应不一，因此不同解剖部位肾组织出现不一样的病理改变，在糖尿病肾病早期主要是系膜细胞和肾小管上皮细胞的增生和肥大，以及基底膜的增厚，这与本研究模型组和治疗组病理切片结果显示一致。传统观念认为，肾小球系膜细胞肥大、系膜基质增加、基底膜增厚、细胞外基质积聚是造成蛋白尿的主要机制［6］。蛋白尿是DN早期最主要的临床特征，也是肾功能进行性恶化的主要因素之一。从临床上看，糖尿病肾病蛋白尿起始表现为微量白蛋白尿，随着病情的进展，可呈现大量蛋白尿，即非选择性蛋白尿，并最终发展为肾小球硬化而进入终末期肾病［7］。本研究结果也表明，肾小球系膜细胞、系膜基质和基底膜的变化与蛋白尿的产生有着密切的联系。

在肾小球滤过膜中，足细胞是一种高度分化和特异化的上皮细胞，是维持整个肾小球滤过膜正常通透性的主要成份，足细胞结构的完整性和数量维持一定的比率是保证肾小球滤过膜功能正常运行的基础。目前认为足细胞损伤是肾小球滤过屏障功能受损的一个关键环节，并认为足细胞在DN蛋白尿的形成发展中起着关键作用，它数量的减少和功能的异常是DN早期微量白蛋白产生的主要原因。足细胞损伤具体表现为足细胞形态的损伤，黏附功能受损和细胞凋亡，出现细胞脱失与细胞数量的减少，从而导致滤过膜完整性受损。研究［1-2］表明DN患者尿蛋白的产生与足细胞数目和密度有着密切的联系，甚至认为足细胞脱失的比率与尿蛋白的量呈正相关。这提示足细胞对肾小球基底膜的黏附失常与脱落，是DN蛋白尿发生的主要因素之一。

黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，药用迄今已有2 000多年的历史，其单体主要有黄芪甲苷和黄芪多糖，传统主要用于气虚不固、气虚不运等证候。现代药理研究发现黄芪及其单体有增强机体免疫功能、保肝、抗衰老、抗应激、抗菌、降压、降糖和利尿护肾等作用。在护肾方面［8-9］，黄芪单体除对肾小管损伤有一定的保护作用外，对DN肾小球损伤亦有良好的保护作用。许多研究结果表明黄芪有益于糖尿病和DN早、中期的控制，可以明显延缓DN的进展。李志杰等［9］的研究结果表明黄芪单体可增加早期DN大鼠足细胞的nephrin和podocin蛋白表达水平，可明显延缓DN的病理进展。本实验结果亦表明，AS-IV对处于DN早期大鼠的肾脏病变有较好疗效，主要体现在:(1)使血糖降低，改善高血糖状况;(2)使肾脏肥大减轻，改善DN状态下微观病理结构;(3)使24 h尿微量白蛋白量降低，改善DN状态下蛋白等大分子物质的流失;(4)提高足细胞黏附分子的表达，减少足细胞脱失。研究结果显示，ASIV可提高大鼠肾皮质β1整合素的表达水平而降低α-actinin-4和ILK的表达水平，从而对足细胞黏附功能产生有益的作用。我们推测AS-IV对黏附分子的影响，可能与AS-IV降低血糖、影响DM多种病理机制和调节免疫机能有关。从中医理论分析，黄芪甲苷是黄芪中的主要单体之一，很可能具有黄芪的益气固摄功能，从而可以提高体内气的固摄能力，改善“气虚”状态，而在微观上即表现为对足细胞结构完整性的维护和促进黏附分子的表达，从而可以使DN患者足细胞恢复和维持一定的黏附能力。

［1］Weil EJ，Lemley KV，Mason CC，et al.Podocyte detachment and reduced glomerular capillary endothelial fenestration promote kidney disease in type 2 diabetic nephropathy ［J］.Kidney Int，2012，82(9):1010-1017.

［2］Reidy K，Susztak K.Epithelial-mesenchymal transition and podocyte loss in diabetic kidney disease［J］.Am J Kidney Dis，2009，54(4):590-593.

［3］Teiken JM，Audettey JL，Laturnus DI，et al.Podocyte loss in aging OVE26 diabetic mice［J］.Anat Rec(Hoboken)，2008，291(1):114-121.

［4］Toyoda M，Najafian B，Kim Y，et al.Podocyte detachment and reduced glomerular capillary endothelial fenestration in human type 1 diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2007，56(8):2155-2160.

［5］Zhang M，Liu M，Xiong M，et al.Schisandra chinensis fruit extract attenuates albuminuria and protects podocyte integrity in a mouse model of streptozotocin-induced diabetic nephropathy［J］.J Ethnopharmacol，2012，141 (1):111-118.

［6］Wolf G，Ziyadeh FN.Molecular mechanisms of diabetic renal hypertrophy［J］.Kidney Int，1999，56(2):393-405.

［7］Fukuda A，Chowdhury MA，Venkatareddy MP，et al.Growth-dependent podocyte failure causes glomerulosclerosis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23(8):1351-1363.

［8］马莲顺，肖植涛，叶杰成，等.黄芪甲苷拮抗马兜铃酸Ⅰ所致的急性肾小管损伤［J］.中国病理生理杂志，2012，28(11):1966-1970.

［9］李志杰，张悦，刘煜敏，等.黄芪多糖对早期糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin和podocin表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2011，27(9):1772-1776.

Protective effect of astragaloside IV on kidney of diabetic nephropathy rats

GUO Wei-wen1，2，LI Shuai2，CHEN Ling-ling1，2，LU Wen-song1，2，LI You-sheng1
(1Department of Traditional Chinese Medicine，Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen People's Hospital，Shenzhen 518020，China;2Department of Traditional Chinese Medicine，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:deyti@163.com)

AIM:To observe the protective effect of astragaloside IV(AS-IV)on the kidney of diabetic nephropathy(DN)rats and its mechanism.METHODS:Male SD rats(n=38)were divided into normal group(n=10)，model group(n=14)and AS-IV intervention group(n=14).The rats in model group and intervention group were injected with streptozotocin for inducing DN.One week after the success of modeling，the blood glucose and urinary microalbumin were dynamically monitored every 4 weeks during the study.After treatment for 12 weeks，the rats were sacrificed，the blood samples and the renal cortex were collected.HE staining and Masson staining were applied for observing the pathological changes of the renal tissues.The protein levels of β1integrin，integrin-linked kinase(ILK)and α-actinin-4 were also detected.RESULTS:At the end of the 8th week，the glucose level in AS-IV intervention group was significantly lower than that in model group(P＜0.01).After 12 weeks of treatment，compared with model group，the amount of urinary microalbumin in AS-IV intervention group was significantly decreased(P＜0.01)，and the inverse changes of the β1integrin，ILK and α-actinin-4 expression in AS-IV intervention group were also observed(P＜0.05).Compared with normal group，the levels of β1integrin，ILK and α-actinin-4 in model group were significantly different(P＜0.05).CONCLUSION:AS-IV has a protective effect on DN kidneys.AS-IV reduces blood glucose and urinary albumin excretion，improves the adhesion of podocytes and delays the development of DN.

Astragaloside IV;Diabetic nephropathies;Podocytes;Proteinuria

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.029

1000-4718(2014)02-0351-04

2013-10-30

2014-01-06

深圳市科技研发资金资助项目(No.JCYJ20120830163410835;No.JCYJ20130402092657779)

△通讯作者Tel:0755-22943819;E-mail:syzyklys@163.com