白细胞介素17在狼疮性肾炎小鼠中的表达及抗白细胞介素17抗体的干预作用*

徐靓，张慧涛，郑晶，贾宁，林琳，林宇静，李玲玲，周文英，张桦△

(中山大学附属第五医院1肾内科，2病理科，3中心实验室，广东珠海 519000)

白细胞介素17在狼疮性肾炎小鼠中的表达及抗白细胞介素17抗体的干预作用*

徐靓1，张慧涛1，郑晶1，贾宁1，林琳1，林宇静2，李玲玲3，周文英3，张桦1△

(中山大学附属第五医院1肾内科，2病理科，3中心实验室，广东珠海 519000)

目的:探讨白细胞介素17(IL-17)在狼疮性肾炎(LN)小鼠中的表达及抗IL-17抗体的干预作用。方法：11周龄的雌性MRL/lpr小鼠36只随机分为实验组和干预组，另有同龄雌性昆明小鼠18只为对照组。干预组每只小鼠腹腔注射抗小鼠IL-17多克隆抗体20 μg，每2周1次，至实验观察点结束。各组分别于第1次给药后的24 h、14 d及28 d处死6只小鼠。光镜下观察肾脏病理情况，ELISA法检测小鼠血清IL-17的含量，免疫组化法检测肾组织IL-17的表达水平。结果:MRL/lpr小鼠肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，肾小管上皮细胞颗粒及空泡变性，灶状萎缩，肾间质淋巴及单核细胞浸润伴纤维化;而干预组肾脏病理改变较实验组为轻。MRL/lpr小鼠的血清IL-17含量在实验组各时点均显著高于对照组(P＜0.05)，而在干预组各时点均显著低于实验组(P＜0.05)。IL-17在实验组小鼠肾小管上皮细胞中的表达明显增强，在各时点均显著高于对照组(P＜0.05);在干预组，IL-17在各时点的表达均显著低于实验组(P＜0.05)。结论:IL-17在MRL/lpr小鼠血清与肾组织中的表达显著增加，而抗IL-17抗体可通过抑制IL-17的表达而抑制LN的炎症免疫反应，减轻肾脏病理损害。

狼疮性肾炎;白细胞介素17;抗白细胞介素17抗体

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的累及多脏器、多系统的自身免疫性疾病，肾脏是其最常见的受累器官，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是SLE致残和致死的首位原因［1］。LN发病机制复杂，突出表现为多种自身抗体并通过免疫复合物等途径诱导的炎症免疫反应，而炎症通路的激活、炎症细胞(特别是巨噬细胞和T细胞)的浸润及炎症因子的表达发挥着重要作用［2-4］。研究表明，白细胞介素(interleukin，IL)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和各种趋化因子参与LN的发病及活动状态，从而引起和促进肾脏损伤。其中近年发现的IL-17是LN发病机制中重要的细胞因子之一，其通过与受体特异性结合发挥促进炎症反应和免疫应答等多种生物学效应［2-4］。目前尚不清楚拮抗IL-17的产生及其功能能否减轻LN的肾脏损伤。为此，本实验通过观察IL-17在不同周龄的MRL/lpr小鼠血清及肾脏中的表达变化，同时使用抗小鼠IL-17抗体进行干预，探讨IL-17在LN炎症免疫反应中的作用以及抗IL-17抗体的干预效果。

材料和方法

1 动物与试剂

健康雌性11周龄SPF级狼疮小鼠(MRL/lpr)36只和昆明小鼠18只，体重25～26 g，购自广东省实验动物中心［许可证号为SCXK(粤)2008-0002］，饲养环境:广东省实验动物中心SPF级实验室。

小鼠IL-17 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司;兔抗小鼠IL-17免疫组化多克隆抗体、两步法免疫组化检测试剂盒购自武汉博士德公司;抗小鼠IL-17多克隆抗体购自上海今迈生物科技公司。

2 方法

2.1 实验分组11周龄雌性的MRL/lpr小鼠36只，适应性喂养1周后，随机分为实验组和干预组，每组18只。另设相同周龄昆明小鼠18只为对照组。

干预组每只小鼠腹腔注射抗小鼠IL-17多克隆抗体20 μg，实验组及对照组小鼠腹腔注射等容量生理盐水，每2周1次，至实验观察点结束。

各组分别于第1次给药(抗IL-17抗体或生理盐水)后的24 h(12周龄)、14 d(14周龄)及28 d(16周龄)各处死6只小鼠，取血标本和肾脏。以上实验在广东省实验动物中心SPF级实验室完成。

2.2 形态学观察及IL-17含量测定制备肾组织石蜡切片，行HE染色光镜下观察肾组织的病理学改变。免疫组化法检测肾组织IL-17的表达水平，实验步骤如下:石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇入水，柠檬酸盐抗原修复液高温高压修复，过氧化物酶封闭液室温孵育，滴加适当浓度Ⅰ抗，4℃过夜复温后滴加Ⅱ抗，DAB溶液显微镜下控制显色，复染细胞核、分化、反蓝，梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封片。用PBS代替Ⅰ抗作为空白对照。阳性结果为细胞质染色呈棕黄色，采用全自动图像分析系统对结果进行半定量分析。结果判定:采用阳性面积百分率评分(0～4分)与阳性强度评分(0～3分)的积分表示。用ELISA法检测血清IL-17含量，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

3 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，肾脏免疫组化结果采用半定量分析，组间均数的差异采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，多个样本均数两两之间的比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 肾脏病理改变

对照组小鼠肾脏肾小球、肾小管及肾间质未见异常。在实验组，MRL/lpr狼疮小鼠肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，伴局灶节段中到重度加重，肾小管上皮细胞颗粒及空泡变性，灶状萎缩，肾间质淋巴及单核细胞浸润伴纤维化，肾血管内膜增生，管腔变窄。上述改变从12周龄到16周龄逐渐加重。而在干预组，12周龄时小鼠肾脏病理情况无显著变化，在14和16周龄时肾小球系膜细胞和基质增生以及肾小管上皮细胞损伤减轻，肾间质淋巴及单核细胞浸润减少。

2 血清IL-17含量的变化

实验组小鼠的血清IL-17含量在各时点均显著高于对照组(P＜0.05)，且随着时间的延长呈现进行性升高。而在干预组，小鼠血清IL-17含量在各时点均显著低于实验组(P＜0.05)，但仍高于对照组(P＜0.05)，见表1。

表1 MRL/lpr小鼠血清IL-17含量的变化Table 1.The levels of serum IL-17 in MRL/lpr lupus mice(ng/ L.Mean±SD.n=6)

3 肾组织IL-17的表达

IL-17主要表达于肾小管上皮细胞胞质中，在对照组仅有微量表达，在实验组则有高表达，且随小鼠周龄增加表达逐渐增强，在各时点均显著高于对照组(P＜0.05)。干预组IL-17的表达水平在各时点均较实验组显著降低(P＜0.05)，但仍高于对照组(P＜0.05)，见图1、表2。

Figure 1.The expression of IL-17 in the renal tissues of MRL/ lprlupusmice(immunohistochemicalstaining，×400).A:Kunming mice in control group;B: MRL/lpr mice of 12 weeks in experimental group;C: MRL/lpr mice of 14 weeks in experimental group;D: MRL/lpr mice of 16 weeks in experimental group;E: MRL/lpr mice of 12 weeks in intervention group;F: MRL/lpr mice of 14 weeks in intervention group;G: MRL/lpr mice of 16 weeks in intervention group.图1 MRL/lpr小鼠肾组织IL-17的表达

表2 IL-17在MRL/lpr小鼠肾脏中的表达情况Table 2.The expression of IL-17 in the renal tissues of MRL/lpr lupus mice(Mean±SD.n=6)

讨论

MRL/lpr狼疮小鼠模型是一种研究LN发生机制和评价LN治疗方法及效果的理想模型，是目前应用最为广泛的研究LN的实验动物模型之一。本实验选择12～16周龄的MRL/lpr小鼠作为实验对象，探讨IL-17在LN的早期发生机制和炎症免疫反应中的作用。结果显示，IL-17在实验组MRL/lpr小鼠的血清含量显著增高，在肾小管上皮细胞中的表达明显增强，而且随着小鼠周龄的增加，IL-17呈现进行性升高，同时肾脏病理改变逐渐显著，且间质内呈现淋巴细胞及单核细胞浸润。这些结果提示，IL-17参与了LN的发病和病理生理过程。

IL-17可由许多免疫细胞产生，而T淋巴细胞是其主要来源，主要包括CD4+T细胞亚群的Th17细胞和双阴性T细胞。其生物学功能是具有强大的致炎性，它能促进多种细胞合成并释放多种生长因子和趋化因子(如IL-8、单核细胞趋化蛋白-1、生长调节因子-α)，并与TNF-α、IL-1等细胞因子有着复杂的相互作用和协同效应;同时IL-17具有强大的募集中性粒细胞的作用，使单核细胞和中性粒细胞迅速增多和大量聚集，并刺激产生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和前列腺素E2，增强局部炎症和免疫损伤;此外，IL-17可促进B淋巴细胞产生免疫球蛋白，增强B淋巴细胞的功能［4-9］。近年多项研究表明，SLE和LN患者或动物体内有高水平的IL-17表达，肾组织中出现IL-17生成细胞(双阴性T淋巴细胞)浸润，且IL-17水平与疾病的活动性及严重性相关［6，10-14］;LN患者或动物的肾组织不仅可检测到产生IL-17的T淋巴细胞，而且模型鼠的临床表现随着鼠体内IL-17的产生减少而改善［5，15］。可见IL-17参与LN的炎症免疫反应过程，并在其中扮演着重要角色。

为进一步探讨IL-17在LN的发病和病理生理过程中的作用，本实验还设立了干预组，使用抗小鼠IL-17抗体对MRL/lpr小鼠进行预处理，结果显示:干预组小鼠在腹腔注射抗小鼠IL-17抗体后，在各时点IL-17的血清含量均显著降低，肾组织中的表达亦显著减少。同时，14周龄后MRL/lpr小鼠的肾脏病理情况得到改善。这些结果提示，使用抗小鼠IL-17抗体能显著拮抗MRL/lpr小鼠产生的内源性IL-17，从而影响IL-17的生物学效应。抗IL-17抗体可以作为一种阻断剂，通过抑制或下调IL-17在LN中的表达而达到抑制LN炎症免疫反应、改善肾脏病变的效果。其他学者的类似研究亦表明，IL-17及其受体可作为LN治疗的一个新靶点［3，5，11，13］。

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Expression of interleukin-17 and role of anti-interleukin-17 antibody in MRL/lpr lupus mice

XU Liang1，ZHANG Hui-tao1，ZHENG Jing1，JIA Ning1，LIN Lin1，LIN Yu-jing2，LI Ling-ling3，ZHOU Wen-ying3，ZHANG Hua1
(1Department of Nephrology，2Department of Pathology，3Centre of Laboratory，The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China.E-mail:zh3196@126.com)

AIM:To investigate the expression of interleukin-17(IL-17)and the role of anti-IL-17 antibody in MRL/lpr lupus mice.METHODS:Female MRL/lpr lupus mice(n=36)were randomly divided into experimental group and intervention group，and female Kunming mice(n=18)served as control group.Each mouse in intervention group received intraperitoneal injection of 20 μg anti-mouse IL-17 antibody.The histological examination of the kidney samples was conducted under optical microscope with HE staining.The serum concentration of IL-17 was measured by ELISA.The protein expression of IL-17 in the renal tissues was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTS:Remarkable pathological changes of the renal tissues in experimental group，such as diffuse hyperplasia in glomerular mesangial cells and stroma，granular denaturation of renal tubular epithelial cells，and focal infiltration of lymphocytes and monocytes in renal interstitial，were observed.Significant improvement of renal histology in intervention group was found compared with experimental group.The level of serum IL-17 in experimental group obviously increased as compared to that in control group.The level of serum IL-17 in intervention group was lower significantly than that in experimental group.The protein expression of IL-17 in the renal tissues in experimental group was increased as compared to control group.The expression of IL-17 in intervention group was apparently less than that in experimental group.CONCLUSION:The levels of IL-17 in the serum and renal tissue significantly increase in MRL/lpr lupus mice.Anti-IL-17 antibody may suppress the inflammatoryreaction and renal injury by down-regulating the expression of IL-17 in the mice with lupus nephritis.

Lupus nephritis;Interleukin-17;Anti-interleukin-17 antibody

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.027

1000-4718(2014)02-0343-04

2013-09-15

2013-11-26

广东省科技计划(No.2009B03081374);珠海市医学科研基金(No.20110042)

△通讯作者Tel:0756-2528189;E-mail:zh3196@126.com