血清her－2ECD和cox－2水平与非小细胞肺癌患者临床病理特征及预后的关系

陈为军，仲昭坤，张恩宁，周冬梅，宫新玲

血清her－2ECD和cox－2水平与非小细胞肺癌患者临床病理特征及预后的关系

陈为军＊，仲昭坤，张恩宁，周冬梅，宫新玲

（烟台市烟台山医院南院肿瘤内科二病区，山东烟台264000）

目的 探讨血清her－2和cox－2浓度与非小细胞肺癌（NSCLC）患者临床病理特征和长期预后之间的关系。方法 采用ELISA法检测非小细胞肺癌组221例，肺部良性疾病组41例血清中her－2和cox－2浓度，比较不同患者血清her－2和cox－2浓度差异，探讨两者的相关性及对预后的影响。结果 her－2和cox－2在非小细胞肺癌患者血清水平明显高于肺部良性疾病患者，差异均有统计学意义（P＜0．05）；且均与肿瘤分期呈正相关（Spearman秩相关系数r分别为：0．830，0．719，P＜0．05）。单因素分析显示血清her－2和cox－2浓度的表达均与患者生存有密切关系（P＜0．05）；多因素分析显示血清her－2和cox－2浓度均不是影响预后的独立危险因素，而两者联合检测可预测病人的预后相对危险度为1．5（1．08－2．09）。结论 非小细胞肺癌患者血清中her－2和cox－2阳性表达明显相关。两者的联合检测有助于非小细胞肺癌的预后评估。

非小细胞肺癌；her－2；cox－2；ELISA

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0227）

我国城市中肺癌病死率位居恶性肿瘤之首，非小细胞肺癌占肺癌发病率的80%，近年来对非小细胞肺癌的分子生物学的研究越来越深入。Her－2在NSCLC的表达率为16%－57%，部分研究结果显示her－2的高表达与NSCLC的预后相关，外周血可测得her－2胞外域蛋白（ECD）［1］。Cox－2是近年被关注的肿瘤靶点，在多种肿瘤包括NSCLC高表达，有研究结果提示高表达与预后差相关，但结论不一［2］。其中两者在非小细胞肺癌中的研究多集中于免疫组化层面，而采用血清进行研究的却鲜有报道，两者均可在外周血中测得，本研究采用ELISA法定量检测非小细胞肺癌患者治疗前血清her－2与cox－2水平，观察治疗前血清中两者的水平是否可判断病人的预后，进一步验证两者在血清中表达是否具有相关性。

1 材料与方法

1．1 临床资料

收集2008年1月至2009年12月在山东省烟台市烟台山医院肿瘤内科住院的非小细胞肺癌患者共221例，入组之前未经过任何治疗，详细记录年龄、分期、相关化验指标等临床资料。选取41例肺部良性疾病作为对照组，其中肺部感染性疾病6例，慢性阻塞性肺疾病19例，支气管哮喘16例。随访截止日期为2012年12月，中位随访时间为3年零7个月。

1．2 样本采集及保存

非小细胞肺癌组及对照组均于治疗前清晨抽取空腹静脉血，均为一式三份，3 000r／min离心10 min，取上层血清存于－20℃冷冻保存备用。

1．3 试剂和方法

采用双抗体夹心ELISA法检测两者在血清中的浓度，试剂盒均购自美国ADL公司，实验步骤严格按试剂盒说明书进行。

1．4 判定标准

血清her－2及cox－2阳性判定标准：以血清her－2／neu浓度≥15ng／ml为阳性，＜15ng／ml为阴性；cox－2≥11．90ng／ml为阳性，＜11．90ng／ml为阴性。两者阳性值均为正常值上限。

1．5 统计学处理

用SPSS13．0进行统计学分析，使用Kaplan–Meier法进行生存分析，使用Wilcoxon秩和检验和log－rank检验进行单因素分析，使用Cox回归模型进行多因素分析。定量资料采用_x±s表示，两变量相关关系采用Pearson相关分析，与肿瘤分期的关系采用Spearman秩相关分析，检验水准α＝0．05。

2 结果

2．1 单因素分析

病人的临床资料及单因素分析结果详细总结于表1。

采用Wilcoxon秩和检验对入组病人进行单因素分析（见表1），发现有以下临床特点的病人生存期相对较短（P＜0．05）：ECOG评分≥2分；肿瘤大小及局部浸润范围分期为T3－T4；淋巴结受累情况分期为N1－N3；存在远处转移者；血清白细胞计数＞10＊109者；血清her－2／neu浓度≥15ng／ml者；血清cox－2≥11．90ng／ml者。由此可认为血清her－2和cox－2浓度的表达均与患者生存有密切关系。

log－rank检验不同浓度her－2和cox－2患者的生存率曲线分布差别有统计学意义，χ2＝18．41，P＝0．004；χ2＝10．31，P＝0．01；显示根据治疗前血清her－2绘制的生存概率见图1，显示血清her－2阳性者预后差；根据治疗前血清cox－2绘制的生存概率见图2，显示血清cox－2阳性者预后差。

表1 病人临床资料及单因素分析

图1 血清her－2分组的累计生存率曲线

2．2 多因素分析

图2 血清cox－2分组的累计生存率曲线

多因素分析显示，以下临床特点为独立的预后不良因素（相对危险度及95%可信区间）：ECOG评分≥2分：2．28（1．59－3．27）；有淋巴结受累者2．0（1．38－2．99）；存在远处转移者1．48（1．04－2．09）。血清her－2与cox－2水平均不能单独成为非小细胞肺癌的独立预后因素，而两者联合检测可预测病人的预后1．5（1．08－2．09）

2．3 血清her－2与cox－2水平（见表2）

2．3．1 血清her－2与cox－2水平：Wilcoxon秩和检验发现两者在非小细胞肺癌组水平均高于肺部良性病变组，差异均有统计学意义（P＜0．05）；进一步亚组分析提示两者与肿瘤分期呈正相关（Spearman秩相关系数r分别为：0．830，0．719，P＜0．05）。

表2 两组Her－2、Cox－2水平比较

2．3．2 非小细胞肺癌组血清her－2与cox－2水平的关系：呈正相关关系，Pearson相关系数r＝0．717，P＜0．05。

3 讨论

既往关于her－2和cox－2的研究大多依赖于组织标本或细胞系，临床应用具有一定限制，本研究应用ELISA法定量检测非小细胞肺癌患者化疗前血清her－2与cox－2水平，该方法简便易行，患者容易接受，临床可操作性强，可以方便快捷地对非手术病人进行有效地评估及监测，为相应的靶向治疗提供依据，而且便于基层医院开展。

her－2／neu基因是人类表皮生长因子受体（EGFR）家族的第2个成员，定位于人染色体17q21，包括信号肽、胞外区、胞浆区和跨膜区，其中胞外区（extra－cellular domain，ECD）相对分子质量为（97－115）×103kD，可被基质金属蛋白酶切割进入外周血［3］。her－2在正常情况下处于非激活状态，与其特异性抗体结合后可调节细胞的分裂、分化和增殖，当受到某些致癌因素的作用后，其结构或表达调控失常，转而具有肿瘤转化活性，可促使细胞发生恶性转化，并通过阻止肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤新生血管的生成等途径促进肿瘤细胞的生长及转移［4－5］。her－2癌基因扩增或蛋白过量表达，可见于人类大部分肿瘤组织中［5，6］。既往研究多集中于免疫组化层面，在非小细胞肺癌中血清her－2的研究鲜有报道，有研究［7］表明，正常人群血清中存在由细胞表面脱落的her－2／neu的细胞外区ECD片段，但水平较低（＜15ng／ml）；国内外、相关研究显示血清her－2含量与免疫组化监测癌组织中her－2／neu的表达水平呈正相关［8－10］。本实验发现，约有20%的非小细胞肺癌患者血清her－2呈阳性表达，且与TNM分期呈正相关，对病人进行随访发现该部分患者预后较差，这与目前大部分在免疫组化层面的研究结果一致［11，12］。

环氧化酶－2（Cyclooxygenase－2，cox－2）的基因为诱导表达型基因，在正常组织中多不表达或低表达，但在炎症、肿瘤等情况下，细胞受诱导而大量表达cox－2。目前研究表明，在绝大多数肿瘤组织中均有cox－2表达，其主要通过影响肿瘤细胞的增殖与分化、抑制肿瘤细胞凋亡、影响细胞周期、促进肿瘤血管生成等多个途径在肿瘤的发生发展、侵袭转移过程中起着重要作用［13－15］。文献显示，在几乎所有NSCLC均表达cox－2，并呈广泛的中等强度表达［15］，其阳性表达率又以腺癌最高［14］，同时与肿瘤临床分期、淋巴结转移等密切相关［16－18］。同样，既往研究多集中于免疫组化层面，近年来相关研究提示，血清cox－2表达情况与肺癌组织中cox－2表达情况呈正相关［19］。本实验发现非小细胞肺癌患者血清中cox－2表达阳性率为53．8%，进一步亚组分析提示在Ⅰ、Ⅱ期患者中血清cox－2表达量与对照组比较有显著差异，说明cox－2是肺癌发生的早期事件。同时，在Ⅲ＋Ⅳ期患者高于I＋Ⅱ期患者，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组。以上均说明cox－2表达与TNM分期、转移正相关。同样，对病人进行随访发现，血清cox－2表达阳性的非小细胞肺癌病人预后较差。

在免疫组化层面，国内外已有多项研究证实两者为非小细胞肺癌的预后因素，同时证实两者之间存在相关性。目前研究认为，her－2与cox－2两条通路之间存在交叉和相互作用，her－2可上调血管内皮生长因子（VEGF）及血管通透因子的表达，促进肿瘤新生血管的生成，而由cox－2催化合成的前列腺素本身就是一种血管通透因子，可能作为血管生成剂促进肿瘤的形成。Benoit等［20］发现her－2可通过不同的机制来诱导cox－2的转录，her－2状态可能是cox－2表达的一个决定性因素，her－2可通过Ras—Raf—MEK—MAPK—AP一1／PEA3信号传导通路，诱导cox－2的转录。同时，cox－2对her－2的表达还存在反向调节，cox－2及PGE2可能通过cAMP介导上调her－2的表达。本实验提示，NSCLC患者血清中her－2与cox－2阳性表达呈一致性，进一步验证了上述各种研究结果，而且统计学分析提示两者均不能单独成为非小细胞肺癌的独立预后因素，而两者联合检测可预测病人的预后，提示在NSCLC中her－2与cox－2存在相互调控机制共同促进肿瘤的发生和发展。我们还发现在非小细胞肺癌患者血清中，her－2与cox－2皆为阳性者比两者皆为阴性者，临床分期晚、淋巴结转移率高；同时，对入组病人进行随访发现：her－2与cox－2皆阳性表达病人，无论是否发生淋巴结转移，生存率都差，提示her－2与cox－2共同作用可能会诱导转移，影响预后。以上分析提示，在NSCLC患者血清中her－2与cox－2皆为阳性者预后差。因此，结合本实验结果我们推测her－2与cox－2抑制剂联合使用可能使此类人群获益。

综上所述，通过ELISA法检测血清her－2与cox－2水平，可以方便快捷的对非小细胞肺癌病人进行评估及监测，具有取材简便，操作简单，便于基层医院开展等优点，有可能通过动态观察指标变化来早期发现疾病进展，间接判定疗效、预后等。同时ELISA法客观性较强，也可为her－2与cox－2的靶向治疗提供依据，指导临床治疗。随着科技的不断发展，相信应用ELISA法对血清中her－2与cox－2的浓度进行联合检测将为肿瘤研究及临床治疗开辟新径。

［1］Hirsch FR，Langer CJ．The role of HER2／neu expression and Trastuzumab in non－small cell lung cancer［J］．Semin Oncol，2004，31（1Suppl 1）：75．

［2］Wolff H，Saukkonen K，Anttila S，et al．Expression of cyclooxygenase－2in human lung carcinoma［J］．Cancer Res，1998，58（22）：4997．

［3］Carney WP，Neumann R，Lipton A，et al．Potential clinical utility of serum Her－2／neu oncoprotein concentrations in patients with breast cancer［J］．Clin Chem，2003，49（10）：1579．

［4］Brabender J，Danenberg D，Metzger R，et al．Epidermal Growth factor receptor and HER－2／neu mRNA expression in non－small cell lung cancer is correlated with survival［J］．Clin Cancer Res，2001，7（7）：1850．

［5］Zhou B P，Liao Y，Xia W，et al．HER－2／neu induces p53biquitination via Akt—mediated MDM2phosphorylation［J］．Nat Cell Biol，200l，3（11）：973．

［6］Kuyama S，Hotta K，Tabata M，et al．Impact of her－2Gene and protein status on the treatment outcome of cisplatin－based chemoradiotherapy for locally advanced non－small cell lung cancer［J］．J Thorac Oncol，2008，3（5）：477．

［7］Watanabe N，Miyamoto M，Tokuda Y，et al．Serum C－erbB－2in breastCancer patients．Acta Oncol，l994，33：901－904．

［8］张 阳，付 涛，王英丽，等．HER－2／neu在乳腺癌血清中的表达及意义［J］．中国实验诊断学，2007，11（7）：863．

［9］袁 芃，徐兵河，张 春，等．乳腺癌患者血清Her－2／neu水平及相关性研究［J］．中华肿瘤杂志，2003，25（6）：573．

［10］Volkmar M，lsabell W，Hans J，et al．Prognostic and predictive impact of the Her－2／neu extracellular domain（ECD）in the serum of patients treated with chemotherapy for metastatic breast cancer［J］．Breast Cancer Research and Treatment，2004，86：9．

［11］Parra E，Park J，Saito D，et al．Prognostic index expression of cyclin－D1，cerbB－2and VEGF：metastases vscorresponding primary cancers and metastatic vs non－metastatic adenocarcinomas［J］．Histol Histopathol，2008，23（8）：987．

［12］Nakamura H，Kawasaki N，Taguchi M，et al．Association of HER－2overexpression wih prognosis in non－small cell lung carcinoma：a meta analysis［J］．Cancer，2005，103：1865．）

［13］Kotha S，Andrew J．Cyclooxygenase－2：a molecular target for cancer prevention and treatment［J］．Trends Pharmacol Sci，2003，24（2）：96．

［14］Krysan K，Reckamp KL，Sharma S，et al．The potential and rational for cox－2inhibitors in lung cancer［J］．Anticancer Agents Med Chem，2006，6（3）：209．

［15］Kim HS，Youm HR，Lee JS，et al．Corrlation between Cyclooxygenase－2and tumor angiogenesis in non－small cell lung cancer［J］．Lung Cancer，2003，42：163．

［16］Fang HY，Lin TS，Lin JP，et al．Cyclooxygenase－2in human non－small cell lung cancer［J］．Eur J Surg Oncol，2003，29（2）：171．

［17］Mascaux C，Martin B，Paesmans M，et al．Has COX－2aprognostic role in non－small cell lung cancer A systematic review of the literature with meta－analysis of the survival results［J］．Br J Cancer，2006，95（2）：139．

［18］Patel S，Chiplunkar S．Role of Cyclooxygenase－2in tumor progression and immune regulation in lung cancer［J］．Indian J Bioehem Biophys，2007，44（6）：419．

［19］张 爽，王 杨，丁慧鑫，等．肺癌患者血清环氧化酶一2的水平及临床意义［J］．中国实验诊断学，2009，13（11）：1594．

［20］Benoit V，Relic B，Leval XD，et al，Regulation of HER－2oncogene expression by cyclooxygenase－2and prostaglandin E2［J］．Oncogene，2004，23（8）：1631－1635．

Serum levels of her－2 and cox－2in patients with non－small cell lung cancer and the clinical significance

CHEN Wei－jun，ZHONG Zhao－kun，ZHANG En－ning，et al．
（The Second Ward Section，Department of Medical Oncology，Yantaishan Hospital，Yantai 264000，China）

Objective To investigate the correlations of serum her－2and cox－2levels with clinical pathological characteristics and Long－term prognosis in patients with non－small cell lung cancer（NSCLC）．Methods Enzyme－linked immunoadsorbent assay（ELISA）was used to detect the levels of her－2and cox－2in the serum samples collected from 221 NSCLC patients and 41controls．The concentrations of her－2and cox－2were compared between different patients，and there correlations as well as their influences on prognosis were also analyzed．Results The levels of serum her－2and cox－2were significantly higher in the NSCLC patients than those in the controls（P＜0．05），which were also positively correlated tumor stages（Spearman＇s rank correlation coefficient r：0．830，0．719，P＜0．05）．Univariate analysis showed that serum concentrations of both her－2and cox－2expression were closely correlated with survivals of the patients（P＜0．05）．Multi－factor analysis showed that both her－2and cox－2concentrations in the serum were not independent risk factors influencing prognosis，but their combination can predict the prognosis of patients 1．5（1．08－2．09）．Conclusion Serum levels of her－2and cox－2expression are significantly correlated in NSCLC patients，and combined detection for their expression may be of important value in judgment of prognosis．

non－small cell lung cancer；her－2；cox－2；ELISA

R734．2

A

陈为军，男，32岁，硕士，主治医师，研究方向：肺癌的综合治疗。

2013－04－10）

1007－4287（2014）02－0227－04

烟台市科学技术发展计划项目（项目编号：2009156－3）

＊通讯作者