响应面分析法优化超声提取黑豆皮色素的工艺研究

王玲丽，郭艳茹

(运城学院 生命科学系，山西运城044000)

黑豆又称黑大豆，为豆科植物大豆(Glycine max)的黑色种子，有祛风除热、保肾健脾、活血、利尿、解毒、明目之功效，其药食俱佳，既可以作为食品又可以作为药材［1］。黑豆皮，中药称“料豆衣”，有解毒利尿的功效，含有大量红色素，飞燕草素－3－葡萄糖苷和矢车菊素－3－葡萄糖苷为其主要成份［2］。从黑豆种皮中提取的黑豆皮色素属花色苷类化合物，其色彩鲜明，有良好的染色作用，是一种理想的天然色素和重要的食品添加剂［3］。另外黑豆的色素和多糖有很强的抗氧化功能，其清除自由基能力甚至高于黑米［4］，其清除能力是维生素C的116倍［5］。张瑞芬等研究了黑豆种皮提取物对老龄小鼠具有延缓衰老作用［6］。黑豆花青素有调节毛细血管的渗透作用，可以改善微循环，还会影响免疫功能［7］。一些化学合成色素有慢性毒性，甚至一些还有致癌性，潜在的危害促使人们寻找新的、安全的可食用色素［8］。黑豆皮红色素作为食品添加剂，绿色、健康，相比于合成色素，安全性更高，具有一定的营养价值和医疗作用，并且由于易得的原料，生产技术简单，因此受到越来越多的消费者的青睐［9］。本实验优化了超声提取黑豆皮色素的工艺条件，为黑豆皮色素的综合开发和利用提供理论依据。

1.材料与试剂

黑豆，购于山西省金鼎种业公司。将黑豆浸泡于水中12小时，手工剥皮，阴干后放置60℃电热鼓风干燥箱内进行干燥，研磨成粉末，60目过筛后备用。

乙醇、盐酸、氢氧化钠等化学试剂均为分析纯。

KQ—500DE型数控超声波清洗器;UV759CRT紫外可见分光光度计;HHS型恒温水浴锅;E438酸度计。

2.方法与结果

2.1 黑豆皮色素最大吸收波长的确定

由于天然色素提取物中存在大量非色素成分，因此，黑豆皮红色素测定中，其含量无法直接表示，故本文用吸光值来表示［10］。

精确称取干燥的黑豆皮0.5g，放置于锥形瓶中，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15 mL，调pH至1.5，在60℃、400 W下超声提取50 min，抽滤或离心得到滤液。取1mL提取液，用蒸馏水稀释至10 mL，分别在 472 nm、482 nm、492 nm、502 nm、512 nm、522 nm、532 nm、542 nm、552 nm 下测其吸光值。不同波长下的吸光值如图1。由图可知，黑豆皮色素的吸收峰在波长为512 nm处。

2.2 单因素试验

图1 黑豆皮色素最大吸收波长

2.2.1 乙醇浓度对黑豆皮色素的影响

精确称取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，按固液比1∶30，分别加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇各15 mL，调pH至1.5，在60℃、400 W下超声提取50 min，离心得到滤液。于512 nm下测定其吸光度考察乙醇浓度对黑豆皮色素的影响，结果如图2:

图2 乙醇浓度对黑豆皮色素的影响

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，黑豆皮色素吸光值逐渐增大，当乙醇浓度增至60%时，其吸光值最大，随后随乙醇浓度增加，吸光值呈下降趋势。因为黑豆皮色素中花色苷为主要成分，所以黑豆皮色素呈中等极性。根据“相似相溶”原理，黑豆皮色素易溶于中等或中等偏上极性的溶剂中。在乙醇溶液中，由于羟基的引入，彼此以氢键相连的乙醇分子之间，和水分子也形成氢键，降低了水的极性［11］。所以提取剂浓度选为体积分数60%。

2.2.2 固液比对黑豆皮色素的影响

精确称取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，分别按固液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 加入60%的乙醇，调pH至1.5，在60℃、400 W下超声提取50 min，离心得到滤液。于512 nm下测定其吸光度考察固液比对提取黑豆皮色素的影响，结果如图3:

图3 固液比对黑豆皮色素的影响

由图3可知，固液比小于1∶40时，黑豆皮色素不能被完全提取出来，随着固液比进一步增加至1∶40时，吸光值达到最大，因此，最佳固液比为1∶40。

2.2.3 pH值对黑豆皮色素的影响

精确称取干燥的黑豆皮4份，每份0.5 g，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15 mL，分别调pH至0.5、1、1.5、2 四个梯度，在 60 ℃、400 W 下超声提取50 min，离心得到滤液。于512 nm下测定其吸光度考察pH值对黑豆皮色素的影响，结果如图4:

图4 pH值对黑豆皮色素的影响

由图4可知，pH值小于1.5时，黑豆皮色素吸光值随着pH值的增加而增大，当溶液pH值大于1.5时，吸光值急剧下降，这是由于pH值的变化改变了色素的结构，因此选溶液pH为1.5为宜。

2.2.4 超声时间对黑豆皮色素的影响

精确称取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15mL，调 pH 至1.5，在60℃、400 W下分别超声提取40 min、50 min、60 min、70 min、80 min，离心得到滤液。于512 nm 下测定其吸光度考察超声时间对黑豆皮色素的影响。结果图5:

图5 超声时间对提取黑豆皮色素的影响

由图可知，超声时间小于60 min时，黑豆皮色素提取不完全。当超声时间大于60 min时，由于黑豆皮色素会因时间的延长，而逐渐氧化分解，吸光值开始下降。因此以60 min为超声提取时间。

2.3 优化实验

2.3.1 响应面分析因素水平的选取及实验设计

综合考虑单因子实验结果，根据 Box－Behnken的中心组合设计原理，采用响应面法在四因子三水平上对超声提取黑豆皮色素的工艺条件进行了优化，因子和水平见表1:

表1 响应面分析因子和水平

数据处理采用 Design expert 8.0.4软件，中心组合实验设计方案及色素吸光值的响应值见表2。其中29个试验点分为析因点和0点，其中析因点为自变量，取值在由－1，0，1构成的三维顶点，0点为区域的中心点，重复试验5次，用来估计试验误差。

表2 响应面分析实验结果

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2.3.2 回归模型的建立及其分析

利用Design Expert 8.0.4软件，通过响应面回归方程分析数据(分析结果见表3)，建立吸光度的回归模型，寻找其最优的反应条件。根据参数分析对实验数据进行多项式拟合回归，得到实验实际的回归方程如下:

表3 模型回归系数显著性检验和结果检验

从表3模型系数显著性检验可知:实验模型对实验拟合良好，模型的P＜0.0001，表明该实验模型显著。另外，A、B、D、A2、B2、C2、D2影响显著，交互项均不显著。失拟项的F值是2.17，其P＞0.05，表明失拟项相对于纯误差是不显著的。各交互因素响应曲面图见图6。

图6 各因素交互作用的等高线和响应面图

2.3.3 优化条件的模型验证

利用Design－Expert8.0.4统计软件求解回归方程得到黑豆皮色素的最佳提取工艺条件为:固液比1∶36.23，乙醇浓度是 55.25%，超声时间 62.73 min，pH值为1.41。此时黑豆皮色素吸光值为0.707。为了验证响应面法的可靠性，同时考虑到实际生产操作的便利性，对得到的最佳提取工艺条件进行验证实验，以固液比1∶36，乙醇浓度是55%，超声时间63min，pH值1.4，此时黑豆皮平均色素吸光值为0.692，与理论值相差较小，因此通过响应面法优化得到的黑豆皮色素的超声提取工艺条件是可行的，具有实际生产价值。

3.结论

黑豆是一种传统的黑色食品。黑豆有清除自由基、抗衰老、增强免疫力、改善睡眠等保健功能。黑豆皮色素作为黑豆中的有效成分是一种理想的天然食用色素［12］。目前有关黑豆种皮红色素提取方法主要有盐酸－乙醇提取法、微波辅助提取法和超声波辅助提取法［13］。其中超声技术提取天然有效成分具有明显的优势，利用超声波产生的强大的振动、空化效应、搅拌作用，可以使活性成分快速溶入溶剂，有效提高萃取率，缩短提取时间。将黑豆皮色素用超声波提取法直接从天然植物黑豆皮中浸提，生产工艺简单合理，提取过程不使用任何手段或药剂导致色素产生有害变化。因此，可广泛用于药品、化妆品、食品的着色和配料，是一种具有广阔前景及应用价值的天然色素［14］。

响应面分析是一种最优化方法，它是将体系的响应作为一个或多个因素的函数，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，运用图形技术将这种函数关系显示出来，使人们可以凭直接的观察来从实验设计中选择最优化的条件，通过对回归方程的分析寻找最优的工艺参数［15］。黑豆皮色素提取的最佳工艺条件为:固液比1∶36.23，乙醇浓度是 55.25%，超声时间 62.73 min，pH值为1.41。

实验过程中有些黑豆皮粉末会沉积在锥型瓶底部，采用磁力搅拌有望提高黑豆皮红色素的提取效果。

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