镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠Raf-1 mRNA和蛋白表达的影响*

谢鑫,张林,陈士玉,杨芳,张立德

(辽宁中医药大学教学实验中心,沈阳 110032)

镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠Raf-1 mRNA和蛋白表达的影响*

谢鑫,张林,陈士玉,杨芳,张立德

(辽宁中医药大学教学实验中心,沈阳 110032)

目的 研究不同剂量镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠(SHR)心血管组织Raf-1蛋白和Raf-1 mRNA表达的影响。方法将50只24周龄SHR随机分为模型对照组、中药小剂量组、中药中剂量组、中药大剂量组、阳性对照组,每组10只,同源雄性魏-凯二氏大鼠(WKY)10只作为正常对照组。灌胃给药5周后,Western Blot法测定心血管组织Raf-1蛋白表达,实时聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定大鼠Raf-1 mRNA基因表达。结果与模型对照组比较,其他各组大鼠Raf-1蛋白和Raf-1 mRNA表达均明显升高(F=1 139.282,sig=0.000,P＜0.01)。结论镇肝熄风汤可促进SHR心血管细胞Raf-1蛋白和Raf-1 mRNA表达,刺激细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡。

镇肝熄风汤;高血压,自发性;Raf-1 mRNA

随着生活饮食的改变、社会环境的变化,以及工作节奏和压力的变化等,高血压疾病患者逐年增多,且呈年轻化趋势。高血压是以血压增高为主,伴有心血管组织病变、心血管细胞凋亡增多的一类疾病。Raf蛋白激酶是由raf基因编码的蛋白产物,其分子结构中含有3个保守区,分别为CR1、CR2、CR3。CR1位于其分子的氨基端,富含半胱氨酸,含有锌指样结构,与蛋白激酶C的配体结合区结构相似,是活化的Ras与Raf-1蛋白激酶结合的主要部位。Raf-1蛋白在心血管组织中大量表达,Raf蛋白参与细胞增殖、细胞分化、抑制细胞凋亡、细胞周期停滞等作用[1]。镇肝熄风汤出自《医学衷中参西录》[2],具有镇肝息风、滋阴潜阳作用,用于治疗肝阳上亢、气血上逆证,临床可改善阴虚阳的症状,治疗高血压及其并发症具有一定疗效。笔者在本实验中以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)为研究对象,观察镇肝熄风汤对心血管组织纤维肉瘤蛋白1(rapidly accelerated fibrosarcoma 1,Raf-1)蛋白表达和Raf-1 mRNA表达的影响,以及该药对心血管细胞凋亡的影响,探讨镇肝熄风汤对原发性高血压降血压的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 20周龄雄性SHR50只,雄性魏-凯二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)10只,体质量(200±20) g,SPF级别,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2012-00011,动物合格证号:20120038。饲养条件:动物室温度20～25℃,相对湿度45%～55%。

1.2 药物与试剂 镇肝熄风汤:生代赭石30 g(先煎)、生龙骨15 g(先煎)、生牡蛎15 g(先煎)、炙龟板15 g(先煎)、牛膝30 g、钩藤15 g、黄芩15 g、栀子15 g、甘草5 g、白芍20 g、丹参20 g、川芎15 g、玄参15 g,药材采购自辽宁中医药大学附属医院药店(产地山东,中药经辽宁中医药大学基础医学院张林老师鉴定,均为合格正品);药材常规煎煮水提,加水1 400 mL(8倍量),浸泡30 min,其中生代赭石、生龙骨、生牡蛎、炙龟板先煎20 min,再加入方中其余药材,煎煮25 min,煎好后用8层纱布过滤,收集药液。完达山5%脱脂奶粉(批号: 1013163904);一抗兔抗大鼠Raf-1抗体(Cell Signaling Technology:04-739)(批号:04-739);二抗羊抗兔碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)标记(批号: MFCD03839167);引物:上游5'-AGAGGCAGAGGTCAACG-3',下游5'-CGAGCCAATCCGAGTA-3',反转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒和实时定量试剂盒购于TaKaRa(RR014A);PCR扩增仪(9700,ABI),核糖核酸提取试剂盒(Triozol Reagent, Invitrogen Life technologies,15596-026,上海科敏生物科技有限公司);722分光光度计(上海精科实业有限公司,722N)。

1.3 药物剂量与分组 按人与大鼠体表面积比换算给药等效剂量[3],大鼠给药剂量=X(mg·kg-1)× 70 kg×0.018/(200 g)=X(mg·kg-1)×70 kg×0.018/ (0.2 kg)=6.3X(mg·kg-1)=(260/60)×6.3= 27.09 g·kg-1。中药小剂量组:13.5 g·kg-1,中药中剂量组:27.1 g·kg-1,中药大剂量组:54.2 g·kg-1,给药浓度分别是2.5,5.0,10 g·mL-1,复方罗布麻片0.126 g·kg-1,浓度0.02g·mL-1,灌胃体积1.08 mL·d-1,早晚各灌胃1次,连续给药30 d。

采用随机数字表法,将健康雄性50只SHR分成5组:模型对照组(0.9%氯化钠溶液)、中药小剂量组(镇肝熄风汤13.5 g·kg-1)、中药中剂量组(镇肝熄风汤27.1 g·kg-1)、中药大剂量组(镇肝熄风汤54.2 g·kg-1)、阳性对照组(复方罗布麻片混悬液, 0.126 g·kg-1),每组10只。健康同源性WKY大鼠10只,作为正常对照组(0.9%氯化钠溶液)。

1.4 Western blot测定 每组大鼠取主动脉弓后,每个样本加入总蛋白裂解液,在冰块中操作匀浆,酚试剂法进行蛋白定量,用722分光光度计在波长650 nm处测定吸光度(A)值,配成同体积同浓度后,加入电泳缓冲液(Running Buffer)煮沸,加样进行分离胶和浓缩胶板中跑胶,取胶放入转印槽中转移,取出转印膜,5%脱脂奶粉封闭,漂洗液(Tween 20 in trisbuffer saline, TTBS)清洗,加入一抗(1∶1 000稀释),加入二抗(1∶300稀释),加入碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)色液显色。

1.5 实时荧光定量反转录酶-聚合酶链反应(Real Time RT-PCR)测定 每个样本加入TRIzol法抽提总RNA,在冰浴中迅速匀浆,加入三氯甲烷,12 000×g离心15 min(4℃),吸取上清液,加入异丙醇摇匀, 12 000×g离心15 min(4℃),弃去上清液,加75%乙醇1 mL,7 500×g离心(30 min,4℃),弃去上清液,加无核酸酶水(Nuclease free water)。采用紫外可见光分光光度计测定260和280nm波长处的A值,配成同体积同浓度后,加入RT-PCR试剂盒中试剂(按说明书操作)逆转录合成cDNA,加入Real-time PCR试剂进行实时定量PCR扩增(按说明书操作)。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0版统计软件处理所得数据,选用ONE WAY ANOVA方法进行统计分析,所得数据以均数±标准差(±s)表示,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot结果 见图1和图2。与模型对照组比较,其他各组Raf-1蛋白表达明显升高(F= 1 868.267,sig=0.000,P＜0.01)。

2.2 Real Time RT-PCR结果 见图3～图7。与模型对照组比较,其他各组Raf-1 mRNA表达明显升高(F=1 139.282,sig=0.000,P＜0.01)。

图1 6组Raf-1与GAPDH蛋白表达Fig.1 Protein expression of Raf-1 and GAPDH in six groups

与模型对照组比较,*1P＜0.01图2 6组Raf-1/GAPDH灰度值比较Compared with model control group,*1P＜0.01Fig.2 Comparison of the ratio of Raf-1 grayscale to GAPDH grayscale among six groups

图3 心血管组织中Raf-1扩增曲线Fig.3 Amplification curve of Raf-1 in cardiovascular tissue

3 讨论

Raf-1是大鼠肉瘤蛋白/纤维肉瘤蛋白/丝裂原活化蛋白激酶(Ratsarcoma/RapidlyAccelerated Fibrosarcoma/mitogen-activated protein kinase,Ras/Raf-1/MAPK)细胞增殖信号传导途径中重要的因子,Raf-1与其他信号传导存在联系。Raf-1被激活后,使其下游的丝裂素活化蛋白激酶活化,通过对转录调节因子表达的影响而将细胞增殖信号传递到细胞核内[3]。Raf-

图4 心血管组织中Raf-1融解曲线Fig.4 Dissolution curve of Raf-1 in cardiovascular tissue

图5 内参GAPDH扩增曲线Fig.5 Amplification curve of GAPDH

图6 内参GAPDH融解曲线Fig.6 Dissolution curve of GAPDH

与模型对照组比较,*1P＜0.01图7 Raf-1/GAPDH mRNA扩增比值Compared with model control group,*1P＜0.01Fig.7 Amplification ratio of Raf-1 mRNA to GAPDH mRNA

1参与细胞分化过程,细胞分化过程中均发现伴有Raf-1、MAPK活性增高。Raf-1还参与抑制细胞凋亡过程[4]。

大量研究表明[5-6],长期原发性高血压会引起心血管细胞大量凋亡,血管壁结构改变,失去弹性,会造成动脉痉挛,血管内压持续升高,血管内皮细胞初期通过细胞骨架来适应调节,然而最终不能承受血压持续升高和长期的作用,血管壁渗透性增多,血浆蛋白的渗入和未坏死血管中膜层产生蛋白多糖、修复性胶原纤维,减少血管细胞壁细胞,而Raf-1蛋白是参与细胞凋亡途径中重要的因子之一。

镇肝熄风汤的方剂出自《医学衷中西参录》[7],本方证是由阴虚阳亢、肝风内动所致。临床应用有较好的效果,方中重用怀牛膝,降其上行之血并能滋养肝肾;若肝阳上升,肺胃之气随之也升,故以赭石降肝胃之逆气,并能平肝潜阳为主药;诸药合用,顺肝脏条达之性,自可趋于和平。使阴足阳潜,气血以和,其风当自平,则成镇肝熄风之剂[8-10]。本实验证明,镇肝熄风汤能促进SHR心血管细胞中Raf-1蛋白表达和Raf-1 mRNA表达,刺激细胞增殖和细胞分化,抑制心血管细胞凋亡程序,从而保持心肌细胞功能和活性,起到降低血压、保护心血管组织的作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.006

Effect of Zhengan Xifeng Decoction on Raf-1 mRNA and Protein Expression in Spontaneously Hypertensive Rats

XIE Xin,ZHANG Lin,CHEN Shi-yu,YANG Fang,ZHANG Li-de
(Teaching and Experiment Center,Liaoning University of Traditonal Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

ObjectiveTo study the effect of different doses ofZhengan xifengdecoction on Raf-1 mRNA and protein expression in the cardiovascular tissue of spontaneously hypertensive rats(SHR).MethodsA total of 50 male SHR,24 weeks old,were randomly divided into the model,low dose,medium dose,high dose ofZhengan xifengdecoction and the compound apocynum groups,10 in each group.Ten homologous male rats(WKY)served as the normal control group.After gavaged for 5 weeks,western blotting and RT-PCR were used to detect the Raf-1 protein and mRNA expression in the cardiovascular tissue,respectively.ResultsCompared with the model control group,both Raf-1 protein and mRNA expressions significantly increased in all treatment groups(P＜0.01).ConclusionTheZhengan xifengdecoction can stimulate cell proliferation and inhibit cell apoptosis by up-regulating the expression of Raf-1.

Zhengan xifengdecoction;Hypertension,spontaneous;Raf-1 mRNA

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1423-04

2013-09-03

2013-10-15

*辽宁省教育厅资助项目(2011164)

谢鑫(1982-),男,辽宁沈阳人,讲师,在读博士,研究方向:中西医结合治疗心血管和原发性高血压疾病。电话:024-31207016,E-mail:xieyanze2002@aliyun.com。

张立德(1960-),男,辽宁朝阳人,教授,博士,研究方向:中西医结合治疗心血管和原发性高血压疾病。E-mail:xieyanze2002@yahoo.com.cn。