林可霉素对小鼠肠道屏障作用的影响*

杜开先,罗予,张燕,董燕

(1.郑州大学第三附属医院小儿神经内科,郑州 450052;2.河南省医药科学研究院免疫研究室,郑州 450052; 3.河南省红十字血液中心检验科,郑州 450003)

林可霉素对小鼠肠道屏障作用的影响*

杜开先1,罗予2,张燕3,董燕1

(1.郑州大学第三附属医院小儿神经内科,郑州 450052;2.河南省医药科学研究院免疫研究室,郑州 450052; 3.河南省红十字血液中心检验科,郑州 450003)

目的 观察盐酸林可霉素对小鼠肠黏膜屏障的损伤作用。方法将24只小鼠均分为正常对照组和造模组。造模组给予盐酸林可霉素灌胃,建立小鼠肠黏膜破损及肠道菌群失调模型。检测两组小鼠肠道菌群,分析细菌易位及通透性情况[检测血浆二胺氧化酶(DAO)]。结果小鼠灌服盐酸林可霉素3 d,肠道菌群失调。正常对照组需氧菌易位率16.7%,造模组52.3%;正常对照组厌氧菌易位率8.3%,造模组68.2%。上述指标比较,造模组均显著高于正常对照组,且差异有统计学意义(P＜0.01)。正常对照组血浆DAO(2.08±0.05)mg·mL-1,造模组(7.18± 0.10)mg·mL-1,造模组高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论盐酸林可霉素对小鼠肠黏膜屏障有损伤作用。

林可霉素;肠道菌群;黏膜屏障

抗菌药物的广泛和长期应用,导致肠道菌群紊乱日益受到关注。肠道屏障由理化、生物、机械、免疫等屏障构成,任何屏障受损肠道黏膜通透性就会增加[1]。肠道菌群失调可导致肠道屏障受损,引起继发性感染,严重者可危及患者生命。盐酸林可霉素属于窄谱抗菌药物,临床广泛用于治疗各种感染,尤其是厌氧菌感染。已有研究表明,盐酸林可霉素短期大量给药可造成小鼠菌群失调,肠道组织损伤,免疫功能受损[2-3]。笔者在本实验中探讨盐酸林可霉素对实验动物肠道屏障通透性的影响,旨在为临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种小鼠,清洁级,体质量18～22 g,平均(20.00±1.24)g,雌雄各半。河南省实验动物中心提供,动物生产许可证号:SCXK(豫)2010-002,动物使用许可证号:SYXK(豫)2011-0010,实验动物合格证号:SCXK(豫)2005-0001。

1.2 药物与试剂 盐酸林可霉素注射液(300 g·L-1,上海旭东海普药业有限公司,批号: 070509),邻苯二茴香胺(O-dianisidine,Sigma公司,批号:102175464,纯度:99%),辣根过氧化酶(peroxidase-horseradish,Sigma公司,批号:102065348,纯度:RZ≥150 μg·mL-1),盐酸戊二胺(cadaverinedihydrochloride,Sigma公司,批号:101098572,纯度≥98%),二胺氧化酶标准品(diamine oxidase,DAO, Sigma公司,批号:1001145922,灵敏度: 3.9 mU·mL-1)。

1.3 培养液 伊红美兰培养液(eosin methylene blue medium,EMB),肠球菌选择性培养液(enterococcus selective medium,EC),乳酸杆菌选择性培养液(lactobacilli select medium,LBS),类杆菌选择性培养液(bacteroides selective medium,BD),双歧杆菌选择性培养液(bifidobacterium selec medium,Blb)[4]。上述培养液均按照参考文献[4]自行配置。

1.4 仪器与设备 紫外分光光度计(PE Lambda 35),厌氧罐(英国OXOID,HP 0011A)。

1.5 肠黏膜损伤模型建立 取小鼠20只,灌胃盐酸林可霉素,4 mg·kg-1,bid,共5 d。每天观察小鼠神态、大便情况,随机处死4只小鼠,裸眼观察小鼠肠黏膜完整性,以小鼠肠黏膜出现溃疡破损为肠黏膜损伤[3]。

1.6 对肠道屏障作用的影响 取小鼠12只作为正常对照组,灌服0.9%氯化钠溶液;另取小鼠12只造模,灌服盐酸林可霉素。均4 mg·kg-1,bid,连续3 d后处死,检测各项指标。

1.7 肠道菌群的检测 取小鼠鲜粪便约0.2 g,加无菌0.9%氯化钠溶液制成10倍稀释液,振荡均质,稀释至10-6,取25 μL分别滴种各选择性培养液,EMB及EC置孵箱35℃培养16～24 h后计数,Blb、LBS和BD置厌氧罐35℃培养48～72 h后计数[3],计算各菌每克粪便中菌落形成单位(CFU·g-1)。

1.8 细菌易位检测 将小鼠浸泡于70%乙醇内1 h,在超净工作台内无菌取肝脏、肺脏、肾脏及腹腔液,分别置增菌液中培养,每种器官标本分别进行需氧和厌氧培养,观察细菌生长结果。需氧培养24 h后,涂片观察,并接种于EMB和EC培养液上,24 h后观察结果。以EMB或EC培养液平板生长有菌落为该器官需氧菌生长阳性。厌氧培养48 h后涂片观察,并接种于LBS、BD和Blb培养液,24 h后观察并涂片鉴定。以LBS或BD或Blb培养液平板生长有菌落,且为厌氧菌者为该器官厌氧菌生长阳性,计算易位率。易位率(%)=阳性器官个数/(小鼠数×4)×100%。

1.9 血浆DAO的测定 摘眼球取血,离心,血清置于-80℃冰箱保存,分光光度计测定血清DAO含量[5]。

1.10 统计学方法 所有资料用SPSS12.0版统计软件包进行处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,独立样本t检验,计数资料组间比较采用χ2检验,按α=0.05水准,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠黏膜损伤模型 盐酸林可霉素灌胃第2天,小鼠反应差,大便软,第3天至第5天均出现小鼠肠黏膜破损和炎症递质渗出。

2.2 肠道菌群的定量检测 与正常对照组比较,造模组5种肠道菌群发生显著变化,其中双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌数量显著降低,而肠球菌、类杆菌数量有所升高,见表1。

2.3 细菌易位率 正常对照组小鼠细菌易位较少,需氧菌为16.7%,厌氧菌为8.3%;造模组细菌易位率,需氧菌为52.3%,厌氧菌为68.2%。造模组均显著高于正常对照组,且差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 肠黏膜通透性 正常对照组外周血DAO为(2.08±0.05)mg·mL-1,造模组DAO含量为(7.18± 0.10)mg·mL-1,造模组显著高于正常对照组(P＜0.01)。

3 讨论

感染性疾病的主要治疗手段是合理应用抗菌药物,但长期大量应用抗菌药物易导致肠道微生态失调,引起二重感染,给治疗带来新的困难。肠道中的双歧杆菌、乳酸杆菌等是有益菌[6]。正常情况下,双歧杆菌、类杆菌、乳酸杆菌等是肠道中优势菌;菌群紊乱时,双歧杆菌、乳酸杆菌数量减少,它们与条件致病菌的数量变化可作为肠道菌群失调程度的判断标准。在肠道菌群失调性腹泻时,球菌数量显著增加并多于杆菌数量。杨晓燕等[7]研究表明,乳糖酸红霉素、头孢氨苄、盐酸林可霉素及氨苄西林钠均能导致小鼠肠道菌群失调,其中盐酸林可霉素的作用稳定而持久。谢莉敏等[3]研究表明低剂量灌胃盐酸林可霉素可用于制备小鼠肠道菌群失调模型,高剂量给药可对小鼠机体造成损害。本实验应用盐酸林可霉素造成小鼠肠道菌群失调和肠黏膜破损模型,肠道菌群严重失调,其中肠道有益菌(双歧杆菌、乳酸杆菌)大量下降,而肠杆菌、类杆菌和肠球菌大幅度升高。肠道屏障中的生物屏障受到损伤。

表1 两组肠道菌群检测结果Tab.1 Results of test on intestinal flora in two groups logCFU·g-1,±s

表1 两组肠道菌群检测结果Tab.1 Results of test on intestinal flora in two groups logCFU·g-1,±s

与正常对照组比较,*1P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.05

组别肠杆菌肠球菌双歧杆菌乳酸杆菌类杆菌正常对照组6.36±0.355.83±0.329.56±0.199.98±0.387.38±0.23造模组8.13±0.32*17.07±0.41*16.67±0.08*17.09±0.14*18.87±0.17*1

DAO是一种具有高度活性的细胞内酶,存在于哺乳动物的黏膜和绒毛上层细胞中,以空肠、回肠绒毛上皮细胞中含量最高,活性较强,而在其他组织中,含量较少,活性也低[5]。当肠黏膜上皮细胞受损坏死后该酶释放被吸收入血,导致血浆和肠腔中DAO升高,而肠黏膜DAO活性降低。因此,可以通过测定外周血中DAO含量的变化,来反映肠黏膜上皮细胞的损伤和肠黏膜上皮细胞损伤后的修复情况。本实验中,正常对照组血清中DAO的含量为2.08 mg·mL-1,经盐酸林可霉素灌胃后上升至7.18 mg·mL-1,表明肠黏膜受损严重。肠道屏障中的机械屏障受到损伤。

细菌移位是指由于肠道屏障功能受损而使肠道内细菌进入肝、脾、淋巴结以至全身血液循环的过程[8]。肠道是重症感染病原菌的储存库,在正常情况下,各菌群经常会有少量细菌向周围发生横向或纵向转移,但由于数量少,以及原籍菌的生物拮抗作用和宿主的免疫机制,不会转移成功。抗菌药的大量长期使用、不合理用药、长期禁食、器官移植、应激等,可导致肠道微生态破坏,机体免疫力降低,肠道动力下降,条件致病菌过度繁殖,转移菌数量过大,易位就成为可能。本实验结果表明,正常小鼠肠道细菌向脏器的易位率需氧菌为16.7%,厌氧菌为8.3%;经盐酸林可霉素灌胃后肠道细菌易位到各脏器的细菌增加,易位率明显增加,需氧菌为52.3%,厌氧菌为68.2%。所以维持肠道内环境稳态,保护机体免受病原微生物入侵显得尤为重要[9]。

[1] HECHT G.Innate mechanisems of epithelial host defense; spotlight on intestine[J].Am J Physiol,1999,277(3 Pt 1): C351-C358.

[2] 邝枣园,高智群,张韧,等.盐酸林可霉素造成小鼠肠道菌群失调规律的研究[J].吉林医学,2009,30(13):1230-1231.

[3] 谢莉敏,李丹,程秀芳,等.盐酸林可霉素对小鼠肠道菌群的影响[J].安徽农业科学,2013,41(9):3913-3914.

[4] 罗予,冯羡菊.临床厌氧菌检测及图解[M].北京:中国协和医科大学出版社,2007:74-99.

[5] 黎君友,于燕.分光光度法测定血和小肠组织二胺氧化酶活性[J].氨基酸和生物资源,1996,18(4):28.

[6] 黄煌,郑鹏远,罗予.双歧杆菌对免疫功能低下小鼠肠道屏障功能的影响[J].临床医学,2012,32(5):1-3.

[7] 杨晓燕,李辉,苏鸿雁.小鼠肠道菌群失调动物模型的制备[J].楚雄师范学院学报,2008,23(12):53-55.

[8] BERG R D.Translocation of certain indigenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric mouse model[J]. Infet Immunity,1979,23(2):403-411.

[9] 王坚镪,汤瑾,蒋燕群.益生菌对大鼠肠道菌群紊乱和细菌易位的影响[J].上海交通大学学报:医学版,2006,26 (2):163-165.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.008

《中国实验方剂学杂志》是由国家中医药管理局主管、中国中医科学院中药研究所和中国中西医结合学会中药专业委员会主办的学术刊物,已成为“中国中文核心期刊”、“中国科技论文统计源期刊(2013年扩刊版)”、“中国学术期刊综合评价数据库来源”期刊、“中国期刊网、中国学术期刊光盘版”全文收录期刊、美国《化学文摘》统计源期刊;并被评为“中国中医药优秀期刊”及“中国学术期刊优秀期刊”。该刊创建于1995年10月,主要设置栏目:学术专论、综述、工艺与制剂、化学与分析、药物代谢、药理、毒理、临床、数据挖掘等。读者对象是从事中西医药,尤其是方剂教学、科研、医疗、生产的高、中级工作者,以及中医药院校的高年级学生等。

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Effect of Lincomycin on the Intestinal Mucosa Barrier of Mice

DU Kai-xian1,LUO Yu2,ZHANG Yan3,DONG Yan1
(1.Department of Pediatrics,the Third Affiliated Hospital, Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China;2.Henan Academy of Medical and Pharmaceutical Science, Zhengzhou,450052 China;3.Department of Clinical Laboratory,Henan Province Red Cross Blood Center, Zhengzhou 450003,China)

ObjectiveTo study the effect of lincomycin hydrochloride on the intestinal mucosal barrier of mice.MethodsA total of 24 mice were equally and randomly divided into normal control group and model group.Mice in the model group were administered with 8 mg·kg-1·d-1of lincomycin hydrochloride through gastric lavage for 3 days to establish the model of intestinal mucosa injury and alteration of intestinal flora in mice.The intestinal flora was tested,bacterial translocation was analyzed,and mucosa permeability was determined by measuring diamine oxidase(DAO)in plasma.ResultsLincomycin hydrochloride led to alteration of intestinal flora in mice after oral administration for three days in mice.The aerobes translocation rate was 16.7%and 52.3%in the normal and model groups,respectively(P＜0.01).The anaerobes translocation rate was 8.3%and 68.2%in the normal and model groups,respectively(P＜0.01).The plasma concentration of diamine oxidase was increased from(2.08±0.05)mg·mL-1in the normal group to(7.18±0.10)mg·mL-1in the model group(P＜0.01).ConclusionLincomycin hydrochloride damages intestinal mucosal barrier in mice.

Lincomycin;Intestinal flora;Intestinal mucosal barrier

R978.1;R969

A

1004-0781(2014)11-1131-03

2013-08-28

2013-09-20

*河南省属科研单位社会公益预研项目(0641130102)

杜开先(1972-),男,河南民权人,副教授,硕士生导师,硕士,研究方向:小儿神经系统疾病与微生态。电话: 0371-66903322,E-mail:dukaixian@126.com。

罗予(1957-),男,河南郑州人,研究员,硕士生导师,学士,主要研究方向:肠道微生态。电话:0371-66658226,E-mail:hnwst_2006@aliyun.com。