罗格列酮对血管内皮细胞胰岛素抵抗及ROS/IKK的影响*

陈芳辉,杨人泽,罗新辉,钟声,李泽玲,曾韬慧,魏桂林

(赣南医学院第一附属医院药剂科,赣州 341000)

罗格列酮对血管内皮细胞胰岛素抵抗及ROS/IKK的影响*

陈芳辉,杨人泽,罗新辉,钟声,李泽玲,曾韬慧,魏桂林

(赣南医学院第一附属医院药剂科,赣州 341000)

目的 探讨罗格列酮对高糖诱导胰岛素抵抗(IR)血管内皮细胞的保护作用及可能机制。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分为3组:正常对照组(DMEM培养液,葡萄糖浓度为5.5 mmol·L-1);高糖组(建立高糖诱导内皮细胞IR模型后,葡萄糖浓度为33 mmol·L-1的DMEM中培养24 h);罗格列酮组(建立高糖诱导内皮细胞IR模型后,葡萄糖浓度为33 mmol·L-1的DMEM中加入10 μmol·L-1罗格列酮干预24 h)。检测细胞存活率、细胞上清液一氧化氮(NO)和内皮素(ET-1)水平、线粒体膜电位和活性氧(ROS)变化,以及磷酸化I-κB激酶(p-IKK)和NF-κB抑制蛋白(IKBA)表达水平。结果与正常对照组比较,高糖组细胞存活率和NO水平下降,ET-1水平上升;线粒体膜电位下降, ROS含量升高;IKK磷酸化水平增加,IκBα蛋白表达下调(P＜0.01),罗格列酮可显著逆转上述变化(P＜0.05)。结论罗格列酮可改善高糖诱导血管内皮细胞IR,其机制与抑制ROS/IKK通路有关。

罗格列酮;内皮功能障碍;胰岛素抵抗;活性氧;IκB激酶

胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和血管内皮功能受损是糖尿病及心血管疾病的共同危险因素,在多种代谢性疾病的发病机制中扮演极其重要的角色[1]。高糖可促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量生成,ROS活化IκB激酶(IκB kinase,IKK),介导炎性因子的表达,参与血管内皮IR的调节[2-3]。研究表明,在肝脏、肾脏和心肌中,罗格列酮可抑制IKK表达或磷酸化,调节核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、激活蛋白-1(activating protein-1,AP-1)活性,导致炎症递质表达减少,从而改善IR[4-6],但其在血管内皮IR中的作用及对ROS/IKK通路的影响尚不完全清楚。笔者在本研究中旨在观察罗格列酮对高糖诱导血管内皮细胞IR的影响,并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人脐静脉内皮细胞株HUVEC19 (江西省药理学和分子治疗学重点实验室提供),达尔伯克伊格尔改良培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)培养液(上海立菲生物技术有限公司,批号:8113377),罗格列酮(东京化成工业株式会社,含量>98.0%,批号:5MM4N-FQ),二甲亚砜(美国Sigma,批号:302A0318),胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司,批号:20130423),四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl-tetrazolium,MTT)试剂(北京索莱宝科技有限公司,批号:M8180),磷酸化IκB激酶(phospho-IKKα/β,p-IKKα/β)(Ser176/180)抗体(美国CST,批号:2697),NF-κB抑制蛋白(inhibitory nuclear factorkappa B,IκBα)抗体(美国CST,批号:9242),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(上海拓然生物科技有限公司,批号:E030120-01),一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号: 20130710),人内皮素(endothelin-1,ET-1)检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:201310),线粒体膜电位试剂盒(JC-1法,上海碧云天生物技术有限公司,批号:201304),ROS检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司,批号:KGT010-1)。

1.2 建立高糖诱导内皮细胞IR模型 造模方法参见文献[7],常规培养HUVEC19,待80%融合时,加入含葡萄糖(33 mmol·L-1)的DMEM培养48 h,并用100 nmol·L-1胰岛素处理30 min。

1.3 实验分组及处理 将HUVEC19分为3组:正常对照组,DMEM培养液(葡萄糖浓度为5.5 mmol·L-1);高糖组(建立高糖诱导内皮细胞IR模型后,葡萄糖浓度为33 mmol·L-1的DMEM中培养24 h);罗格列酮组(建立高糖诱导内皮细胞IR模型后,葡萄糖浓度为33 mmol·L-1的DMEM中加入10 μmol·L-1罗格列酮分别干预24 h),检测细胞存活率、细胞上清液一氧化氮(NO)和内皮素(ET-1)水平、线粒体膜电位和活性氧(ROS)变化,以及磷酸化I-κB激酶(p-IKK)和NF-κB抑制蛋白(IKBA)表达水平。

1.4 检测指标 实验结束后,采取MTT比色法检测细胞存活率;按照NO和人内皮素检测试剂盒说明书检测细胞上清液NO、ET-1水平;按照线粒体膜电位试剂盒(JC-1法)、ROS检测试剂盒说明书,流式细胞仪检测ROS含量及线粒体膜电位变化;Western blot法测定p-IKK和IκBα蛋白表达。

2 结果

2.1 罗格列酮对高糖诱导血管内皮细胞IR的影响见表1。建立高糖诱导内皮细胞IR模型后,与正常对照组比较,高糖组细胞存活率和NO水平下降,ET-1水平上升(P＜0.01),提示造模成功[7]。与高糖组比较,罗格列酮组细胞存活率、NO水平上升,ET-1水平下降(P＜0.05)。提示罗格列酮对高糖诱导血管内皮细胞IR具有保护作用。

表1 3组HUVECs存活率、NO和ET-1检测结果Tab.1 Determination of survival rate,NO and ET-1 in three groups of HUVECs ±s

表1 3组HUVECs存活率、NO和ET-1检测结果Tab.1 Determination of survival rate,NO and ET-1 in three groups of HUVECs ±s

与正常对照组比较,*1P＜0.01;与高糖组比较,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;compared with HG group,*2P＜0.05

组别细胞存活率/ % NO/ (μmol·L-1) ET-1/ (pg·mL-1)正常对照组81.31±0.0253.79±5.063.75±0.27高糖组34.11±0.02*129.56±2.51*17.09±0.31*1罗格列酮组43.11±0.02*235.66±2.58*26.18±0.22*2

2.2 罗格列酮对HUVECs线粒体膜电位变化和ROS含量的影响 见表2。与正常对照组比较,高糖组线粒体膜电位下降,ROS水平(荧光强度)升高140.6% (P＜0.01)。而经罗格列酮干预后,线粒体膜电位上升,ROS水平下降35.8%(P＜0.05)。

表2 3组HUVECs线粒体膜电位变化和ROS含量检测结果Tab.2 Determinationofmitochondrialmembrane potential and ROS in three groups of HUVECs ±s

表2 3组HUVECs线粒体膜电位变化和ROS含量检测结果Tab.2 Determinationofmitochondrialmembrane potential and ROS in three groups of HUVECs ±s

与正常对照组比较,*1P＜0.01;与高糖组比较,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with HG group,*2P＜0.05

组别ROS 相对产生量线粒体膜电位正常对照组90.06±10.401.48±0.08高糖组216.67±24.99*10.41±0.04*1罗格列酮组139.17±16.38*21.18±0.07*2

2.3 罗格列酮对p-IKK及IκBα蛋白表达的影响 见图1,2。与正常对照组比较,高糖组IKK磷酸化增加, IκBα表达下调;罗格列酮干预后,IKK磷酸化减少, IκBα表达相应上调(P＜0.01或P＜0.05)。

3 讨论

罗格列酮为噻唑烷二酮类胰岛素增敏药,可通过激活靶组织中的过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)来增强胰岛素传导信号,提高靶组织的胰岛素敏感性,改善IR,抑制血管平滑肌的增殖和迁移,改善内皮功能等[8]。

图1 3组p-IKK及IκBα蛋白表达情况Fig.1 Expression of p-IKK and IκBα in three groups

与正常对照组比较,*1P＜0.01;与高糖组比较,*2P＜0.05图2 3组p-IKK、IκBα蛋白与β-actin蛋白相对比值统计图Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with HG group,*2P＜0.05Fig.2 Relative ratio of the p-IKK and IκBα protein to β-actin in three groups

IR是指机体对一定剂量胰岛素的生物学效应低于正常水平,血管内皮功能障碍与内皮源性血管舒张因子NO下降、缩血管因子ET-1升高及氧化应激等因素有关[9]。许多研究表明,IR和血管内皮功能受损关系紧密,在代谢性疾病和心血管疾病中起了重要作用。本实验中,笔者采用高糖和胰岛素处理HUVECs建立血管内皮IR模型,发现细胞存活率、NO水平下降, ET-1水平升高,提示造模成功。而罗格列酮干预可提高细胞存活率和NO水平,降低ET-1水平,说明罗格列酮治疗后有助于维持血管内皮完整性,对血管内皮IR有保护作用。

在代谢过程中,高血糖可导致线粒体通透性转换孔开放,诱导线粒体膜去极化,产生大量ROS,从而发生氧化应激[10]。氧化应激可激活细胞内包括NF-κB、PKC、JNK、MAPK等应激信号通路,与血管内皮IR的发生、发展密切相关。本实验中,高糖组较正常对照组线粒体膜电位下降,ROS含量升高,而罗格列酮可有效保护线粒体膜电位,降低ROS水平,从而减少炎性因子的产生,增加NO生成,改善IR以及内皮功能受损。

NF-κB是哺乳动物细胞中最重要的核转录因子之一,其参与了炎症、细胞增殖、分化和凋亡等的调节。静息状态下,无活性的NF-κB以异源三聚体(P50, P65,IκBα)形式存在于胞质中。当细胞受到应激时, IKK复合体被磷酸化,磷酸化的IKK复合体继而磷酸化降解IκBα,使NF-κB(P50,P65)转核活化,从而引起靶基因的表达[11-12]。通过IKK/IκBα/NF-κB信号通路,IKK介导了细胞因子(TNF-α,IL-6等)、化学趋化因子、黏附分子和促凋亡基因等表达,从而参与高糖诱导血管内皮IR的调节。本实验结果表明,高糖作用下,IKK磷酸化显著增加,IκBα表达相应下降。而用罗格列酮干预48 h后,p-IKK表达减少,IκBα表达增加,说明罗格列酮能抑制IKK活化,发挥改善血管内皮IR的作用。

综上所述,罗格列酮可改善高糖诱导血管内皮IR,其机制可能与抑制ROS/IKK信号通路有关。

[1] MUNIYAPPA R,SOWERS J R.Role of insulin resistance in endothelial dysfunction[J].Rev Endocr Metab Disord, 2013,14(1):5-12.

[2] QUAGLIARO L,PICONI L,ASSALONI R,et al.Intermittent high glucose enhances ICAM-1,VCAM-1 and E-selectin expression in human umbilical vein endothelial cells in culture:the distinct role of protein kinase C and mitochondrial superoxide production[J].Atherosclerosis, 2005,183(2):259-267.

[3] QI S,XIN Y,GUO Y,et al.Ampelopsin reduces endotoxic inflammation via repressing ROS-mediated activation of PI3K/Akt/NF-κB signaling pathways[J].Int Immuno Pharmacol,2012,12(1):278-287.

[4] 赵彩彦,周俊英,刘雅静,等.罗格列酮抑制非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织IKK-β的表达[J].基础医学与临床,2007,27(11):1231-1235.

[5] 王晓娟,刘素筠.罗格列酮对糖尿病大鼠肾脏中磷酸化IKK和IκBα表达及肾组织超微结构改变的影响[J].实用糖尿病杂志,2010,7(1):26-27.

[6] 祁洁,刘素筠.罗格列酮对糖尿病大鼠心肌组织中磷酸化IKK,IκBα表达的影响[J].中国医疗前沿,2008,20 (3):28-30.

[7] HUANG Q R,LI Q,CHEN Y H,et al.Involvement of anion exchanger-2 in apoptosis of endothelial cells induced by high glucose through an mPTP-ROS-Caspase-3 dependent pathway[J].Apoptosis,2010,15(6):693-704.

[8] ROBINSON E,GRIEVE D J.Significance of peroxisome proliferator-activated receptors in the cardiovascular system in health and disease[J].Pharmaco Therapy,2009,122 (3):246.

[9] 曹维,陈秋.胰岛素抵抗与内皮功能障碍[J].实用医学杂志,2011,27(17):3239-3241.

[10] AHMED M,MUHAMMED S J,KESSLER B,et al.Mitoehondrial proteome analysis reveals altered expression of voltage dependent anion channels in pancreatic β-cells exposed to high glucose[J].Islets,2010,2(5):283-292.

[11] RAUERT-WUNDERLICH H,SIEGMUND D,MAIER E,et al.The IKK inhibitor Bay 11-7082 induces cell death independentfrominhibitionofactivationofNFκB transcription factors[J].PLOS One,2013,8(3):e59292.

[12] RUAN H,POWNALL H J.The adipocyte IKK/NFkappaB pathway:a therapeutic target for insulin resistance[J].Curr Opin Investig Drugs,2009,10(4):346-352.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.005

Effect of Rosiglitazone on Insulin Resistance and ROS/IKK Signaling Pathway in Vascular Endothelial Cells

CHEN Fang-hui,YANG Ren-ze,LUO Xin-hui,ZHONG Sheng,LI Ze-ling,ZENG Tao-hui,WEI Gui-lin
(Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,China)

ObjectiveTo explore the protective effect of rosiglitazone on insulin resistance(IR)induced by high glucose in vascular endothelial cells and its possible mechanism.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells(HUVECs) was divided into 3 groups:the normal control group cultivated in DEME medium with 5.5 mmol·L-1glucose;the high glucose group(HG)cultivated in DEME medium with 33 mmol·L-1glucose for 24 h after the IR model was set up;the rosiglitazone group cultivated in DEME medium with 33 mmol·L-1glucose and 10 μmol·L-1of rosiglitazone for 24 h after the IR model was set up.The cell viability,nitric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),mitochondrial membrane potential,reactive oxygen species (ROS),p-IKK and IkBa protein levels were detected.ResultsCompared with the normal control,the cell viability,the level of NO and the mitochondrial membrane potential were decreased,levels of ET-1 and ROS increased,p-IKK expression was upregulated,and IκBα expression was down-regulated in HG group(allP＜0.01).Rosiglitazone reversed these changes in a timedependent manner(P＜0.05).ConclusionRosiglitazone has the protective effect on insulin resistance induced by high glucose in vascular endothelial cells via inhibiting ROS/IKK signaling pathway.

Rosiglitazone;Endothelial dysfunction;Insulin resistance;Reative oxygen species;IrB kinase

R965;R363

A

1004-0781(2014)11-1420-04

2014-03-04

2014-04-15

*江西省自然科学基金资助项目(2012ZBAB205014)

陈芳辉(1985-),男,江西遂川人,主管药师,硕士,研究方向:药理学。E-mail:chenfh123@163.com。

魏桂林(1968-),男,江西赣州人,主任药师,学士,研究方向:临床药理。E-mail:weiguilin@sina.com。