不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响

谭 军，刘雨虹，刘 影，萨 爽，王 瑞*，赵秀云



不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响

谭 军1，刘雨虹2，刘 影2，萨 爽2，王 瑞1*，赵秀云2

（1.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.华中农业大学生命科学技术学院，武汉 430070）

青枯雷尔氏菌（）是烟草青枯病的病原菌。为有效防治青枯病，研究了不同培养条件对青枯雷尔氏菌生长的影响；并测定了在不同pH、温度以及在培养基中添加不同浓度的N、P、K、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、HCO3-、SO42-对青枯雷尔氏菌生长的影响。结果表明，青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好，青枯雷尔氏菌最适生长温度为25~45 ℃；高浓度的Zn2+和Cu2+能够有效抑制青枯雷尔氏菌的生长，其他因素对青枯雷尔氏菌的生长无明显作用。

青枯雷尔氏菌；影响；生长条件；烟草

烟草青枯病是由雷尔氏菌属的茄假单胞杆菌（）引起的热带亚热带地区烟草的重要病害，是一种典型的维管束病害，一旦发病即可造成全株死亡，对烟草的产量和质量影响极大，是烟草的毁灭性病害[1]。目前对烟草青枯病的防治，仍无十分有效的措施[2]，生产上主要采用农业防治、药剂防治和生物防治，但效果均不显著，缺乏特效的药剂和抗性品种。

本研究详细分析了不同培养条件、矿质元素、微量元素等对青枯病菌生长的影响，为在生产中控制土壤中青枯雷尔氏菌病原而达到控制病害奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 仪器有摇床、分光光度计、pH计、电子分析天平、灭菌锅、超净工作台等。

1.1.2 供试菌株 实验菌株是采用组织分离法，从感染青枯病的烟草根茎部分离获得青枯劳尔氏菌的。

1.1.3 试剂 实验用水为蒸馏水，所用试剂均为分析纯。

1.1.4 培养基 使用NA培养基：牛肉浸膏1.5 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，dH2O 1000 mL，pH为7.2。PDA培养基：土豆200 g，蔗糖20 g，dH2O 1000 mL[3]。

1.2 培养条件

1.2.1 青枯雷尔氏菌的培养 固体培养：无菌条件下，用接种环将保存于-20 ℃的青枯劳尔氏菌菌种划线接种至涂有TTC的PDA培养基上，于28 ℃避光条件下活化24 h备用。

液体培养：将经平板活化的青枯劳尔氏菌菌种接种至NA培养液中，于28 ℃、200 r/min避光条件下进行恒温振荡培养，获得细菌悬浮液。

1.2.2 青枯雷尔氏菌培养特性试验 根据试验要求，分别设置不同的培养温度、pH以及营养条件对青枯劳尔氏菌的培养特性进行检测和分析。

1.2.3 数据处理 数据均为同一条件下3次重复的平均值。

2 结 果

2.1 青枯雷尔氏菌生长曲线的测定

对青枯雷尔氏菌进行液体培养，每隔4 h取样，测定各培养时间菌液的OD600。绘制青枯雷尔氏菌的生长曲线（图1）。

图1 青枯雷尔氏菌的生长曲线

由图1中可以得知，4~16 h青枯雷尔氏菌的生长处于对数期，16~24 h青枯雷尔氏菌的生长处于稳定期。24 h后青枯雷尔氏菌开始衰亡。一般来说选定对数期的菌种作为种子液，因为其生长最快，性质稳定，同时延迟期短。在本次试验中，选定培养15 h的菌液，通过测定菌液的OD600值代表菌种的生长量，通过比较OD值来分析各种因素对青枯雷尔氏菌生长的影响。

2.2 pH对青枯雷尔氏菌生长的影响

将培养基的初始pH分别设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，将对数生长期的菌液按1%的接种量接种于10 mL培养液中，于28 ℃，200 r/min进行恒温振荡培养，15 h后测定培养液的OD600（图2）。

图2 初始pH对青枯雷尔氏菌生长的影响

2.3 温度对青枯雷尔氏菌生长的影响

将培养温度设置为15、20、25、30、33、35、37、40、45、50 ℃。将处于对数生长期的菌液按1%的接种量接种于10 mL培养液中，于28 ℃，200 r/min进行恒温振荡培养，15 h后测定各培养液的OD600（图3）。

图3 温度对青枯雷尔氏菌生长的影响

2.4 氮、磷、钾浓度对青枯雷尔氏菌生长的影响

分别用蒸馏水配制（NH4）2SO4、NaNO3、磷酸盐（NaH2PO4/K2HPO4）、KCl母液，加入培养基中使其终浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、5、8、10 g/L。每处理设3次重复。将处于对数生长期的菌液按1%的接种量接种于10 mL培养液中，于28 ℃，200 r/min进行恒温振荡培养，15 h后测定各培养液的OD600（图4）。

图4 不同氮、磷、钾含量对青枯雷尔氏菌生长的影响

2.5 微量元素（锌、铜、钙、镁）对青枯雷尔氏菌生长的影响

Zn2+(ZnSO4·7H2O)，Cu2+(CuSO4·5H2O)，Ca2+(Ca Cl2·2H2O)，Mg2+(MgSO4·7H2O) 4种微量元素贮备液的配制均为分析纯，用蒸馏水配制成1 mol/L的母液备用。分别加入不同微量元素贮备液，使其终浓度为0、0.01、0.05、0.1、1、1.5、2 mmol/L。每处理设3次重复。将对数生长期的菌液按1%的接种量接种于各处理的培养液中，于28 ℃，200 r/min进行恒温振荡培养，15 h后用720可见分光光度计测定培养液的OD600。观察不同浓度的不同微量元素对青枯雷尔氏菌生长的影响（图5）。

2.6 碳酸氢根和硫酸根离子浓度对青枯雷尔氏菌生长的影响

在培养基中加入NaHCO3或Na2SO4，使培养基终浓度为0、0.5、1、2、3、4、5 g/L，每处理设3次重复。将对数生长期的菌液按1%的接种量接种于各处理的培养液中，于28 ℃，200 r/min进行恒温振荡培养，15 h后，用720可见分光光度计测定培养液的OD600。观察不同浓度的碳酸氢根离子对青枯雷尔氏菌生长的影响（图6）。

图5 锌、铜、镁、钙浓度对青枯雷尔氏菌生长的影响

图6 碳酸氢根和硫酸根离子对青枯雷尔氏菌生长的影响

3 讨 论

由所得数据可知，本次实验所用青枯雷尔氏菌对偏酸或偏碱性的环境下皆能生长，在pH为6.0~10.0范围内生长良好，随着pH的降低或升高，菌体生长量都会明显降低。温度是影响植物细菌性青枯病发生和流行的关键气象因子之一，它通过影响细胞膜的流动性及运输系统的生理活性（酶催化反应等）来影响微生物对营养物质的吸收能力，从而影响细胞的生长繁殖[4]。随着温度的降低或升高，酶活性都会受到影响，菌体生长量都较低，在30~33 ℃生长良好，菌体能有效利用营养物质生长。在培养时间不少于12 h，温度为30 ℃，pH为7左右，培养瓶中空气含量60%以上，青枯菌的菌液浓度较高，其产生的代谢产物也相对较高[4]。

不同氮含量对青枯雷尔氏菌生长的影响不大，菌体对铵态氮和硝态氮的利用明显不好。添加有磷和钾的培养基，青枯雷尔氏菌的生长量与对照组的相比差距很小，随着浓度的增加生长量变化小且没有规律，说明其对青枯雷尔氏菌的生长影响不大。在烟草生产中适当提高钾肥施用量可以减轻病害的发生[5]，青枯病是典型的维管束病害，KNO3可以促进植物维管组织的生长，增强植物的抗逆性[6]。在添加有微量元素的培养基中，锌和铜对青枯雷尔氏菌的生长影响较大，在低浓度时与对照组相比生长量基本一致，而在高浓度时对青枯雷尔氏菌有明显的抑制作用，锌、铜浓度分别为2、1.5 mmol/L时，青枯雷尔氏菌的生长量最低。而钙浓度为2 mmol/L时，青枯雷尔氏菌的生长量最低，与对照组相比效果明显，但相比锌和铜其降低值不明显。青枯雷尔氏菌一旦进入植物体，在导管中快速生长的同时，向胞外分泌多种细胞壁降解酶，而果胶酶就是其中一种。研究表明，钙对青枯雷尔氏菌产果胶酶有一定的影响，低浓度钙（5 mmol/L）能够影响青枯雷尔氏菌产果胶酶，且随钙浓度的加大，总酶活性及酶量越低[7]。在生长实践中可以通过抑制青枯雷尔氏菌的生长，来影响烟草青枯病的发病程度。随着碳酸氢根离子浓度的增加，菌体的生长量有所降低，但是降低值不明显。对青枯雷尔氏菌生长有抑制作用，但是效用不大。不同硫酸根离子浓度对青枯雷尔氏菌生长的影响不突出，与对照组相比生长量差距不明显。

4 结 论

本实验中，添加的矿质元素锌和铜对青枯雷尔氏菌生长影响较大。今后防治烟草青枯病，应遵循农业防治、生物防治和化学防治相结合；“控氮、稳磷、增钾、补微”平衡施肥的原则。适量添加矿质元素锌和铜，既能增加植物抗逆性，又能减少青枯雷尔氏菌数量，可有效缓解青枯病给烟叶带来的危害，是防治烟草青枯病的有效措施。

[1] 朱贤朝，王彦亭，王智法. 中国烟草病虫害防治手册[M]. 北京：中国农业出版社，2003.

[2] 孔凡玉. 烟草青枯病的综合防治[J]. 烟草科技，2003（4）：42-43.

[3] 杨生玉，王刚，沈永红. 微生物生理学[M]. 北京：化学工业出版社，2007.

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[6] 谢建辉，贺红，刘丹，等. 广藿香青枯病菌培养特性的研究[J]. 广东药学院学报，2011，27（1）：39-43.

[7] 李洪. CaCO3对青枯病菌生长的影响及土壤中青枯病菌的定量PCR分析[D]. 重庆：西南大学，2012.

Effects of Different Conditions on Growth of Tobacco

TAN Jun1, LIU Yuhong2, LIU Ying2, SA Shuang2, WANG Rui1*, ZHAO Xiuyun2

(1. Enshi Tobacco Company of Hubei Province, Enshi, Hubei 445000, China; 2. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

is a one of tobacco bacterial wilt pathogens. In order to identify strategies of effective prevention and treatment of bacterial wilt, the effects of different culture conditions, including pH, temperature, N, P, K, Zn2+, Cu2+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, SO42-on the growth ofwere investigated. The results showed thatgrew better in slight acidic or alkali condition. The optimum growth temperature ofwas between 25 and 45 ℃. High concentrations of Zn2+and Cu2+could inhibit the growth of.

; effect; growth conditions; tobacco

S572.08

1007-5119（2014）01-0085-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.016

湖北省烟草公司（专卖局）项目“烟草青枯病病原菌生物学特性及综合防控技术研究与示范”（027Y2013-002）

谭 军，男，农艺师，主要从事烟草栽培与病虫害综合防治。E-mail：kjzx709@126.com。

通信作者，E-mail：wangrui2999@126.com

2013-05-30

2013-12-04