分子排阻色谱法测定注射用磺苄西林钠中高分子聚合物

阮昊，郑小玲，陈悦

(浙江省食品药品检验研究院，杭州 310004)

分子排阻色谱法测定注射用磺苄西林钠中高分子聚合物

阮昊，郑小玲，陈悦

(浙江省食品药品检验研究院，杭州 310004)

目的 建立测定注射用磺苄西林钠中高分子聚合物的方法。方法采用Sephadex G-10凝胶色谱柱,以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液[0.1 mol·L-1磷酸氢二钠溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氢钠溶液(61∶39)]为流动相A,以水为流动相B,流速1.5 mL·min-1,检测波长254 nm。结果磺苄西林高分子聚合物与磺苄西林能较好分离,磺苄西林对照品在进样量为含磺苄西林0.59～47.46 μg范围内,线性关系良好(r=0.999 9);供试品溶液在20.68～40.48 mg·mL-1范围内,溶液浓度与聚合物峰面积呈良好线性关系(r=0.999 4);重复性较好(RSD=4.3%,n=5);重现性较好(RSD=4.8%,n=3)。结论该方法简便,结果可靠,可以用于注射用磺苄西林钠中高分子聚合物的检测。

磺苄西林钠；高分子聚合物；分子排阻色潽

磺苄西林属广谱半合成青霉素类抗生素,主要适用于对本品敏感的铜绿假单胞菌、变形杆菌属以及其他敏感革兰阴性菌所致的肺炎、尿路感染、复杂性皮肤软组织感染和败血症等[1]。

磺苄西林钠致变态反应常见。多年来的研究已证明,在β-内酰胺类抗生素所致的速发型变态反应中,药物分子本身只是半抗原,药物中存在的高分子聚合物才引发速发型变态反应[2],因此严格控制抗生素中高分子聚合物的含量有着重要的意义。《中华人民共和国药典》2010年版采用Sephadex G-10凝胶色谱柱柱床体积变小,减少了分析时间(45～60 min)[3]。在水中,磺苄西林钠由于分子间的氢键、静电相互作用、疏水相互作用等可以形成缔合物[4],与高分子聚合物具有相似的色谱行为,因此可以采用药物自身为对照品,按外标法计算。笔者在文献[5-6]的基础上,优化并建立了测定注射用磺苄西林钠中的聚合物的方法,缩短了分析时间,为更好地控制产品质量提供了参考。

1 仪器与试药

上海金达生化仪器有限公司KFG-1抗生素高聚物分析系统(紫外检测器),色谱柱为葡聚糖凝胶G-10 (40～120 μm)填充柱(内径1.0 cm,柱高40 cm)。磺苄西林钠对照品(浙江省食品药品检验研究院,批号: 20040601,含量:82.4%);注射用磺苄西林钠(苏州二叶制药有限公司,批号:080501;瑞阳制药有限公司,批号:08122212);葡聚糖凝胶Sephadex G-10为进口分装(Amersham Biosciences);磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、蓝色葡聚糖2 000(GE Pharmacia)均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 用葡聚糖凝胶G-10(40～120 μm)为填充剂,玻璃柱(1.0 cm×40 cm),以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液[0.1 mol·L-1磷酸氢二钠溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氢钠溶液(61∶39)]为流动相A,以水为流动相B,流速1.5 mL·min-1,检测波长为254 nm。量取0.2 mg·mL-1蓝色葡聚糖2 000溶液100 μL,注入液相色谱仪,分别以流动相A、B进行测定,理论板数按蓝色葡聚糖2000峰计算,在流动相A与B中理论板数及拖尾因子均符合要求,理论板数为872,919,均大于700,拖尾因子为1.44,1.16,均＜2.0。

2.2 分离度实验 根据《中华人民共和国药典》2010年版[3]附录ⅤH分子排阻色谱法规定,检查高分子聚合物时,某些药物分子单体与其聚合体不能达到基线分离时,其分离度计算公式为:R=高聚体的峰高/单体与高聚体之间的谷高。

分离度实验溶液:由于高分子聚合物的对照品不易获得,而样品中的高聚物又极少,在配制分离度溶液时,适当加入蓝色葡聚糖2 000,使聚合物峰增大。蓝色葡聚糖2 000系在葡萄糖T2 000(平均相对分子质量2 000 000)上引入多环生色团冷冻干燥而成。在凝胶过滤法中,用于各种类型葡萄糖的床空隙容积的测定和校核柱的填充。一般蓝色葡聚糖2 000的加入量是使聚合物峰面积达到规定限度的1～2倍。

称取磺苄西林钠约300 mg,置10 mL量瓶,用0.2 mg·mL-1蓝色葡聚糖溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,进样100 μL,用流动相A进行测定,记录色谱图进行分析,得高聚物峰的含量为0.80%(拟规定限度为0.5%),分离度为2(图1)。

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液 取磺苄西林钠对照品适量,精密称定,加水溶解并定量制成每毫升含磺苄西林60 μg的溶液,以流动相B进样测定。

2.3.2 供试品溶液 取本品约0.3 g,精密称定,置10 mL量瓶,加水适量,使溶解后,用水稀释至刻度,摇匀,以流动相A立即进样测定(图2)。

图1 分离度实验色谱图

图2 供试品的聚合物图谱(流动相A)1.高分子聚合物;2.磺苄西林钠

2.4 专属性实验 已知用蓝色葡聚糖2000溶液实验测得的流出时间(图3),即为Kav=0。在上述规定的色谱条件下,在Kav=0时,样品中有一峰流出(tR为8.6 min),至12 min后药物单体开始流出(图4),且分离度符合要求。故确认为tR为8.6 min时的峰即为聚合物峰。

2.5 对照溶液线性关系考察 精密称取磺苄西林钠对照品14.40 mg,置25 mL量瓶,加水稀释至刻度,摇匀。用水逐步精密稀释,制成分别含磺苄西林5.93, 29.67,59.33,118.66,237.31和474.62 μg·mL-1的溶液,分别按“2.1”项色谱条件以流动相B进行测定。以对照品浓度(C,μg·mL-1)为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,回归方程Y=406.84X+1 679.1,r= 0.9999,表明对照品溶液浓度在5.9～474.6 μg·mL-1范围内(进样100 μL),溶液浓度与测得的峰面积呈良好的线性关系。

图3 流动相B中蓝色葡聚糖2 000(A)与对照溶液(B)的色谱图比较

2.6 定量限与检测限 取“2.5”项5.93 μg·mL-1溶液,精密稀释10倍,按“2.1”项色谱条件以流动相B进行测定,记录色谱图,并对色谱系统进行基线检测,结果最低检测浓度为1.02 μg·mL-1(S/N=3),计算最低检测限为0.003%,最低检测量0.102 μg,最低定量限0.01%(S/N=10)。

2.7 精密度实验 精密称取磺苄西林钠对照品18.96 mg,置于250 mL量瓶,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取100 μL注入液相色谱仪,按“2.1”项色谱条件,以流动相B为流动相进行测定。连续进样5次,记录色谱图,以峰面积计算,RSD为4.1%,小于5.0%,说明精密度良好[3]。

2.8 重复性实验 精密称取注射用磺苄西林钠样品(苏州二叶制药有限公司,批号:080501)约0.3 g,称取5份,分别置10 mL量瓶,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另取精密度实验溶液,作为对照品溶液。按“2.1”项色谱条件测定,分别精密量取100 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。含磺苄西林聚合物以磺苄西林计,结果分别为0.12%,0.11%, 0.10%,0.11%,0.11%,RSD=4.3%,表明本方法重复性良好。

2.9 重复性实验 取样品(苏州二叶制药有限公司,批号:080501),在不同日期按“2.8”项方法共测定3次,结果分别为0.11%,0.12%,0.11%,RSD=4.8%,表明本方法重复性良好。

2.10 样品取样量对聚合物测定结果的相关性考察 分别取样品(苏州二叶制药有限公司,批号:080501) 200,300,400 mg,置3个10 mL量瓶,按“2.1”项色谱条件以流动相A进行测定。以供试品浓度(C, mg·mL-1)为横坐标,高分子聚合物峰面积为纵坐标,进行线性回归,回归方程Y=371.87X+4 820.5,r= 0.999 4,表明供试品溶液浓度在20.68～40.48 mg·mL-1范围内(进样100 μL),供试品溶液浓度与测得的高分子聚合物峰面积呈良好的线性关系。

2.11 样品的聚合物测定 按“2.3.1”和“2.3.2”项方法及“2.1”项色谱条件,测定2批样品磺苄西林聚合物(表1)。

表1 样品中高分子聚合物测定结果 %

3 讨论

3.1 流动相的选择 流动相A:流动相的种类和浓度可以改变溶质的色谱行为和分离效果[7],故选用pH 7.0的0.1,0.05,0.025 mol·L-1磷酸盐缓冲液分别作为流动相A,流速均为1.5 mL·min-1。在pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液作为流动相A时分离最好,故选用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液作为流动相A。

流动相B:选用水作为流动相B,用每毫升约含60 μg的磺苄西林钠溶液,进样100 μL进行测定。结果表明磺苄西林钠在以水作为流动相的条件下能完全缔合形成表观分子量较大的缔合物,在Sephadex G-10凝胶色谱系统中的色谱行为与聚合物相似,都在Kvo= 0处流出,表现为单一色谱峰,故采用自身对照外标法。

3.2 流速的选择 选用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液作为流动相A时,比较流速为1.0和1.5 mL·min-1的分离情况,可见二者分离都较好。因流速为1.5 mL·min-1时分离好且较快出峰,故选用该流速。

笔者在本实验中选用比文献[6-7]盐浓度更高的缓冲液及更快的流速,使得整个样品的分析时间缩短一半以上,且分离效果更好。故本实验建立的注射用磺苄西林钠高分子聚合物检测方法简便快速、结果准确、重现性好,对于保证药品质量和用药安全均具有重要的意义。

[1] 国家药典委员会.临床用药须知[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 金少鸿,胡昌勤.β-内酰胺类抗生素过敏反应的研究进展[J].中国新药杂志,1994,3(4):38-41.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录37,1138-1139.

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[5] 田贵容,吕露阳,方梅.Sephadex G10凝胶色谱法测定磺苄西林钠中的高分子杂质[J].华西药学杂志,2007,22 (6):699-700.

[6] 马晓宁,刘雁鸣.凝胶色谱法测定注射用磺苄西林钠的聚合物[J].中南药学,2009,7(9):659-662.

[7] 蔡姗英,胡昌勤,冯芳.β-内酰胺抗生素在Superdex peptide凝胶过滤色谱柱上的色谱行为[J].中国抗生素杂志,2002,27(3):157-161.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.033

R978.1;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0386-03

2013-02-18

2013-03-20

阮昊(1981-),女,浙江杭州人,主管药师,硕士,主要从事抗生素药品质量研究。电话:0571-86459427,E-mail：clare_ruan@163.com。

陈悦(1971-),男,浙江永康人,主任药师,学士,主要从事抗生素药品质量研究。电话:0571-86459427,E-mail：13868057010@163.com。