双黄连粉针剂超声雾化前后3种成分的质量分析*

韩飞,肖雄,王勍,陈式诚,罗晓健

(1.江西中医药大学药学院,南昌 330004;2.中药固体制剂制造技术国家工程中心,南昌 330006)

双黄连粉针剂超声雾化前后3种成分的质量分析*

韩飞1,肖雄1,王勍1,陈式诚1,罗晓健2

(1.江西中医药大学药学院,南昌 330004;2.中药固体制剂制造技术国家工程中心,南昌 330006)

目的 建立双黄连粉针剂超声雾化液中绿原酸、连翘苷、黄芩苷反向-高效液相色谱(RP-HPLC)同步测定的新方法。方法色谱柱Hypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液(40∶60),流速1.0 mL·min-1,进样量5 μL,柱温30℃,检测波长0～10 min为324 nm,10～25 min为277 nm。结果绿原酸、连翘苷、黄芩苷分别在进样量范围内与峰面积线性关系良好,r≥0.999 7,精密度、重复性、稳定性均RSD＜2%,回收率98.50%～101.12%(n=6)。结论该方法快速、准确、重复性好、分离度高,可同时测定3种成分的含量。双黄连粉针剂超声雾化前后3种成分变化不大。

双黄连粉针剂;绿原酸;连翘苷;黄芩苷;超声,雾化;分析,质量

双黄连粉针剂是由金银花、黄芩、连翘提取物制成的中药制剂,具有清热解毒、宣肺散风的功效,用于治疗病毒及细菌感染引起的扁桃体炎、咽炎、急性支气管炎、肺炎等疾病。从1990年双黄连粉针剂批准上市至今已近24年,在其疗效被肯定的同时也出现了大量的药物不良反应(adverse drug reactions,ADR)报道[1]。2009年2月12日和2009年9月16日,因其严重不良事件,国家食品药品监督管理局两次暂停部分企业生产的双黄连粉针剂的销售和使用[2-4]。双黄连制剂注射给药不良反应的发生率比其他给药途径高出5倍多[5-6]。袁强等[7]的研究结果也表明,双黄连注射剂ADR位居2004年版《国家基本药物目录》中33种中药注射剂之首。近年来,为了避免双黄连粉针剂的不良反应,临床上通常采用超声雾化吸入的给药方法,并取得较好的效果[8-10]。但目前大多数报道只反映其雾化吸入的实际疗效,而很少从制剂基础研究的层面上去探讨其雾化吸入的可行性。笔者建立了测定双黄连粉针剂超声雾化液中黄芩苷、连翘苷、绿原酸的含量检测方法,并对比双黄连粉针剂超声雾化前后3种成分含量的变化,初步研究了其雾化吸入的可行性。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 鱼跃牌4021AI超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司,苏药管械准字2002第223),EPED-20TH纯水器(上海精密仪表有限公司),KQ5200DA超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司),分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,感量0.01 mg),Agilent-1200高效液相色谱仪:Agilent-1200泵,Agilent-1200-VWD检测器,Agilent-1200化学工作站。

1.2 试剂 黄芩苷对照品,连翘苷对照品,绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院提供,批号:110715-201117,110713-201108,110753-201214),双黄连粉针剂(哈药集团中药二厂,批准文号:国药准字Z10940044,规格:600 mg),甲醇(色谱纯,天津市永大化学试剂厂),磷酸(分析纯,天津市永大化学试剂厂),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil 0DS2 C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm,大连依利特公司);流动相甲醇-0.2%磷酸水溶液(40∶60);流速1.0 mL·min-1;进样量5 μL;柱温30℃;检测波长0～10 min,324 nm;10～25 min,277nm。绿原酸的保留时间(tR)3.46 min,连翘苷的保留时间(tR)13.33 min,黄芩苷的保留时间(tR)17.50 min。在上述色谱条件下,3种成分与相邻成分有较好的分离,各成分理论板数均＞4 000。见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、连翘苷、黄芩苷对照品适量,色谱纯甲醇溶解,置10 mL量瓶中,称质量,超声20 min,放冷,甲醇补足失重,用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得绿原酸(0.331 mg·mL-1)、连翘苷(0.203 mg·mL-1)、黄芩苷(0.148 mg·mL-1)的混合对照品溶液。

2.2.2 双黄连粉针(水)溶液的制备 精密称取干燥的双黄连粉针剂500.0 mg,超纯水溶解,置500 mL量瓶中,称质量,超声两次,每次15 min,放冷,超纯水补足失重,用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得双黄连粉针(水)溶液(1.0 mg·mL-1)。

2.2.3 双黄连粉针剂超声雾化液的收集 取干燥的锥形瓶一个,置于装满500 mL水的烧杯中,冷冻12 h,取出,将同口径的雾化导管接于锥形瓶上,密封膜缠封,经检查气密性良好。大雾化杯中装入约500 mL超纯水,小雾化杯中加入“2.2.2”项下制备的150 mL溶液,盖上顶盖,频率调至1.7 MHz±10%,雾化量调至4 mL·min-1,打开电源,雾化30 min后,关闭电源,转移至40℃恒温水浴锅中加热,收集所得雾化液,用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得双黄连超声雾化液。

2.3 线性关系考察 分别精密量取绿原酸(0.331 mg·mL-1)、连翘苷(0.203 mg·mL-1)、黄芩苷(0.148 mg·mL-1)对照品溶液,各0.1,1,2,4,6,8, 10 mL,分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,定容,分别精密吸取溶液各10 μL,注入色谱仪,记录峰面积,以峰面积(Y)为纵坐标,进样量(X)为横坐标进行线性回归,绘制标准曲线。结果表明在进样量范围内线性关系良好。见表1。

A.混合对照品;B.供试品;1.绿原酸;2.连翘苷;3.黄芩苷图1 对照品和供试品HPLC色谱图A.mixed reference substance;B.samples;1.chlorogenic acid; 2.forsythin;3.baicalinFig.1 HPLC of reference substance and samples

表1 3种成分线性关系和范围Tab.1 Linearrelationshipandrangeofthree components

2.4 精密度实验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10 μL,在上述色谱条件下,连续进样6次,测定峰面积。结果显示绿原酸、连翘苷、黄芩苷峰面积相对标准偏差(RSD)分别为0.625%,0.449%,0.903%,表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验 按“2.2.2”和“2.2.3”项方法平行制成6份超声雾化液(批号:20120923),在上述色谱条件下,进样10 μL,测定峰面积。结果显示绿原酸、连翘苷、黄芩苷峰面积RSD分别为1.14%,1.53%, 1.31%。表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性实验 精密吸取同一超声雾化液(批号20120923)10 μL,分别于0,2,4,8,12,24 h,在上述色谱条件下,测定峰面积。结果显示绿原酸、连翘苷、黄芩苷峰面积RSD分别为1.27%,1.09%,1.42%。表明超声雾化液样品在24 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率实验 精密称取18份任意批号的双黄连粉针剂,分成3组,每组6份,分别加入各对照品适量,按“2.2.2”和“2.2.3”项的方法制备成样品溶液,精密吸取样品溶液10 μL。上述色谱条件下,测定峰面积,各成分回收率在98.50%～101.12%。绿原酸、连翘苷、黄苓苷平均回收率依次为99.49%, 99.77%,99.29%;RSD依次为0.849%,0.812%, 0.966%。结果见表2。

表2 绿原酸、连翘苷、黄芩苷加样回收率实验结果Tab.2 Recovery results of chlorogenic acid,forsythin and baicalin

2.8 样品测定 按“2.2.2”项方法制备成供试品5批,在按照“2.2.3”项方法制备成超声雾化液,精密吸取10 μL,在上述色谱条件下测定,按照外标法计算各成分的含量。结果见表3。

2.9 超声雾化前后3种成分含量变化 按照“2.2.2”和“2.2.3”项的方法,各制备一批样品溶液,分别吸取上述两种溶液各10 μL,在上述色谱条件下测定,记录色谱峰面积,测定各成分的含量等。见表4。

表3 不同批号样品绿原酸、连翘苷、黄芩苷测定结果Tab.3 Determinationresultsofchlorogenicacid, forsythin and baicalin from different batch samples mg·mL-1

表4 超声雾化前后绿原酸、连翘苷、黄芩苷含量变化Tab.4 Content changes of chlorogenic acid,forsythin and baicalin before and after ultrasonic atomization

3 讨论

3.1 波长的选择 对于多成分的含量测定,波长的选择是关键。经过紫外扫描,绿原酸、连翘苷、黄芩苷的最大吸收波长分别为324,277,274 nm。由于样品中黄芩苷含量很高,大大超过其他两种成分,因此将一段检测波长设为277 nm,既能将连翘苷的含量有效的测出,又基本不影响黄芩苷的含量值;此外,将另一段检测波长定为324 nm,较利于绿原酸的含量测定,且分离效果非常显著,故最终采用0～10 min,324 nm;10～25 min,277 nm双波长检测法。

3.2 溶剂的选择 由于在临床上,双黄连粉针剂不管是注射给药还是雾化吸入,大多采用注射用水或0.9%氯化钠注射液进行溶解配制,为了与临床实际情况尽可能一致,故本实验采用超纯水作为溶剂。

3.3 流动相的选择 本实验曾尝试过乙腈-水、甲醇-水等流动相,结果分离效果不好。最终确定采用甲醇-0.2%磷酸水(40∶60),此单一流动相可同时分离3种成分,且该方法简便、准确、重复性好、分离度高,所用时间仅为25 min,比文献报道[11-14]的梯度程序洗脱所用时间(至少60 min)大大缩短。

3.4 收集装置的选择 在现用装置前曾尝试连接冰冷冻过的冷凝管,但雾化后小液滴的温度较低,且为液态,而非气态,所以使用热交换法使其冷凝的方式几乎无效,故采用本实验装置,使小液滴在相对封闭的环境中达一定压力从而凝聚为大液滴而形成雾化收集液。另雾化管中亦有雾化液残留,收集量可观,约占最终收集液的90%。同时,雾化过程中,顶盖出雾口有回流现象,故小雾化杯中存留的大量药液有一部分也经过了雾化过程,符合雾化吸入的条件。

3.5 超声雾化参数 本实验所采用的超声雾化参数(超声频率:1.7 MHz±10%;雾化量:4 mL·min-1;雾化时间:30 min),参考了相关文献[15],与临床上采用的参数基本一致,具有一定的代表性,但超声雾化的频率、雾化时间发生较大的变化后,或采用别的雾化方式[16]3种成分的含量是否变化还有待进一步研究。

3.6 超声雾化前后的变化 通过对比双黄连粉针剂雾化前后3种成分的变化发现,其含量的改变极小,出峰数基本相同,4号峰在雾化后消失,但由于其峰面积＜2,含量几乎可以忽略不计。此结果为探讨双黄连粉针剂雾化吸入给药的可行性提供了初步的实验依据。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.026

Quality Analysis of Three Components in Shuanghuanglian Powder for Injection Before and After Ultrasonic Atomization

HAN Fei1,XIAO Xiong1,WANG Qing1,CHEN Shi-cheng1,LUO Xiao-jian2
(1.College of Pharmacy,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China;2.Chinese Medicine Solid Preparations National Engineering Research Center for Manufacturing Technology,Nanchang 330006,China)

Objective To establish a new RP-HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid,forsythin, and baicalin inshuanghuanglianpowder for injection after ultrasonic atomization.MethodsHypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used as the chromatographic column.The mobile phase was methanol-0.2%phosphate acid solution(40∶60). Flow rate was 1.0 mL·min-1.Sample volume was 5 μL.Column temperature was 30℃.Detection wavelength was 324 nm at 0-10 min and 277 nm at 10-25 min.ResultsContents of chlorogenic acid,forsythin,and baicalin had good linear relationship with the respective peak area(r≥0.999 7)within the scope of the sample volume.The RSD was＜2%for precision,reproducibility, and stability.Recovery rate was 98.50%-101.12%(n=6).ConclusionThe method is rapid,accurate and reproducible,with high resolution.It can determine the content of three kinds of components at the same time.The three components inshuanghuanglianpowder for injection did not change significantly before and after ultrasonic atomization.

Shuanghuanglianpowder injection;Chlorogenic acid;Forsythin;Baicalin;Ultrasonic,atomizetion; Inhalation,aerosol

R286;R927.2

A

1004-0781(2014)08-1073-04

2013-12-11

2014-02-18

*江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ13609);江西省科技厅自然科学基金资助项目(20142BAB205083);江西中医药大学自然科学研究项目(2012ZR027);江西省高等学校卓越人才培养计划(制药工程)

韩飞(1981-),男,江西广丰人,讲师,硕士,研究方向:中药新剂型及新技术的研究。电话:0791-87118645, E-mail:hanfei8454871@163.com。

肖雄(1969-),男,江西赣州人,讲师,硕士,研究方向:制药工程及设备。电话:0791-87118645,E-mail: xzy1119@163.com。