植物中的NO及其对花发育的调节

周坤,张今今

陕西师范大学生命科学学院,秦巴山区可持续发展协同创新中心，西安 710062

高等植物的生长发育分为营养生长和生殖生长两个阶段。条件适宜时,植物从营养生长向生殖生长转换,精确的开花时间是植物成功有性繁殖的前提。植物花发育是极其复杂的调控网络,涉及开花转换、花原基分化和花器官发育等过程。对拟南芥(Arabidopsis thaliana) 晚花突变体的研究表明,调节植物开花转换(Floral transition)的 4个主要途径是：光周期途径、春化作用途径、赤霉素途径和自主调节途径[1～3],其中光周期途径和春化作用途径依赖外源信号的刺激,而赤霉素途径和自主调节途径主要涉及内源信号的调节[4]。

一氧化氮( Nitric oxide,NO)是一种脂溶性和微水溶性小分子气体,过去一直被认为是有毒分子,直到1998年诺贝尔生理学医学奖授予了在动物NO信号转导途径方面做出突出贡献的 3位科学家。此后人们逐渐发现作为一个非传统信号分子,NO广泛参与了动物的神经传递、血管紧张性、基因转录、mRNA翻译和蛋白的翻译后修饰等调节过程[5]。同年, Delledonne等[6]和 Durner等[7]发现 NO也能参与植物的防御反应,自此植物学界开始了植物 NO合成及其功能方面的研究。后续研究表明,NO是植物体内一种关键的信号分子,参与植物花发育、光合作用、气孔运动、呼吸作用、种子萌发、细胞死亡及对外界环境的应激反应等生理过程[8～11]。然而NO在这些过程中的信号转导途径却不是很清楚[12],同样,对于植物开花转换和花器官发育中内源 NO的功能也知之甚少。本文将结合植物 NO合成途径的主要研究结果,对其在花发育进程中的作用和调节机制进行总结和评述。

1 植物NO的生物合成

已有众多研究表明植物中有内源 NO的合成,但对植物NO合成机制的理解还不完善。与动物NO合成不同的是,植物有多条潜在的NO合成途径,包括一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)、硝酸还原酶(Nitrate reductase,NR)和黄嘌呤氧化还原酶(Xanthine oxidoreductase ,XOR)催化途径等[13,14]。

1.1 一氧化氮合酶催化途径

在哺乳动物中,NO通过一氧化氮合酶催化底物L-精氨酸、NAD(P)H和氧气产生。动物中有3种NOS,包括存在于各种细胞中的内皮NOS(Endothelial NOS,eNOS)和最早在神经组织中发现的神经元 NOS(Neuronal NOS,nNOS),它们均属组成型表达; 第三种诱导型NOS(Inducible NOS,iNOS) 是一种诱导酶,仅在脂多糖或干扰素诱导时表达[15,16]。

植物中是否存在类哺乳动物 NOS？植物内源NO合成是否类似于哺乳动物？这些都还只是猜测。1996年在白羽扇豆(Lupinus albus L.)根和根瘤中首次检测到 NOS活性,且能被 NOS抑制剂 NG-甲基-L-精氨酸 (NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)所抑制,自此研究者认为植物中也应当存在类哺乳动物 NOS[17]。在早期,线粒体甘氨酸脱羧酶复合物变异P蛋白和拟南芥线粒体蛋白被认为可能是高等植物中的NOS候选蛋白,但随后发现它们并不直接参与植物 NO的合成[18～20]。其中拟南芥 NO合酶(AtNOS1)具有保守的 GTPase域,更有可能是一个功能性 GTP酶,因此被重命名为 AtNOA1(Nitric oxide associated 1)。但是,在拟南芥中能检测到NO合成的稳定中间物N-羟基精氨酸(N-hydroxyarginine,NOHA),因此推测AtNOA1至少能利用NOHA间接催化合成NO[21～23]。Hong等[24]基于AtNOA1基础序列连配和结构特征,推测AtNOA1可能作为GTP酶参与植物线粒体内核糖体的合成或转移,而线粒体正是植物 NO的主要来源之一,因此拟南芥突变体atnos1中内源 NO减少可能是由于缺乏 AtNOA1(AtNOS1),由此也说明AtNOA1在植物NO合成中具有重要功能。L-精氨酸是哺乳动物NOS合成NO的重要底物,因此植物中是否存在依赖 L-精氨酸合成NO的酶,是发现类动物NOS的重要证据。少数情况下,植物NOS-Like蛋白可基于瓜氨酸反应,但特定的组织器官中仍能检测到依赖 L-精氨酸合成NO 的酶活性[25～28]。例如,植物过氧化物酶体的类NOS活性远高于天然提取物中的类NOS活性,动物NOS抑制剂也能降低过氧化物酶体的类NOS活性[29];另外,在动物中广泛应用的 L-精氨酸类似物——Nω-硝基-L-精氨酸甲基酯 (Nω-nitro-L-arginine methylester,L-NAME) 也能抑制植物NO的合成,这些研究都暗示植物中存在类动物 NOS[30]。需要强调的是：以上实验都是假定类动物NOS为靶蛋白,因此在植物中找到 NOS抑制因子确切作用的靶蛋白非常重要[31,32]。尽管以上实验都无法直接证实植物NOS的存在,但多种间接证据仍表明了植物中具有依赖 L-精氨酸的NO合成酶的可能性。

早期被认为是植物 NOS候选蛋白的线粒体甘氨酸脱羧酶复合物变异 P蛋白和 AtNOS1与动物NOS序列同源性都很低,拟南芥中也未发现与动物NOS显著同源的基因[17～19]。但基于植物内源NO合成的事实和诸多实验证据,有学者认为植物NOS与哺乳动物NOS间序列相似性不应太低,前者应至少包含底物参与氧化还原反应的氧化酶和还原酶结构域[5]。因此推测植物NOS的功能域有可能在不同的多肽上,当受到特定信号刺激,这些多肽会自行组合并催化L-精氨酸等底物合成NO[33]。若果真如此,这可能就是尚未能在植物中找到动物NOS同源物的原因,也会使植物NOS的寻找和识别变得更为困难。

1.2 硝酸还原酶催化途径

植物中除了可能的NOS酶催化途径外,还有其他 NO合成机制,其中研究最为清楚的是植物硝酸还原酶途径。细胞溶质中的 NR是高等植物同化硝酸盐的关键酶,主要功能是利用电子供体 NADPH将硝酸盐还原成亚硝酸盐。对大豆 NR突变体的研究发现,无论在体内还是体外 NR都以钼辅因子(Molybdenum cofactor,MoCo)为催化位点,通过一个依赖NAD(P)H的反应催化亚硝酸盐合成NO。NR缺陷的双突变体nia1nia2中亚硝酸盐和NO均有减少,而亚硝酸还原酶(Nitrite reductase,NiR)的反义转基因株系中亚硝酸盐和 NO却均得到积累[34,35]。虽然NR催化亚硝酸盐合成NO仅为还原硝酸盐活性的1%[36～38],但NR途径仍是植物NO合成的重要来源。

NR酶催化NO合成途径受众多因素影响。首先是硝酸盐的竞争性抑制,NR催化的NO合成需要较低的硝酸盐和较高的亚硝酸盐,正常条件下植物体内硝酸盐含量高(1～5 mmol/L)而亚硝酸盐含量很低(10μmol/L),NR不会催化NO的合成,只有在厌氧条件下亚硝酸盐含量增加,可导致 NO释放量剧增100倍[35]; 其次,低pH值能使细胞内质体NiR活性受到抑制而使亚硝酸盐积累[39],进而激活NR使NO的产量明显增加; 再次,NR酶的翻译后修饰也影响NO的产生,当NR蛋白激酶磷酸化NR中的保守丝氨酸,14-3-3蛋白即绑定到磷酸化的NR酶上,使NR以一种依赖Mg2+和Ca2+的形式失活和降解[40]。最后,NR介导的NO合成还受多种生物或非生物因子诱导,如致病疫霉菌(Phytophthora infestans (Mont.) de Bary )激发素 INF1[41]、渗透胁迫[42]、水胁迫[43,44]、多胺[45]、开花转换[11]和低氧条件[46,47]等等。鉴于以上NR合成NO的机制及植物在多种情况下依靠NR合成NO的事实,可以认为植物中的NR更类似于哺乳动物中的组成型NOSs,保证植物基本的内源NO合成[48]。

1.3 其他途径

除以上两种途径外,烟草(Nicotiana tabacum L.)中一个能与根部质膜特异性结合的亚硝酸:NO还原酶(Plasma membrane-bound nitrite：NO reductase,NiNOR)也能催化亚硝酸盐合成NO。体外试验发现,NiNOR 介导 NO合成的电子供体来源可能不是NAD(P)H[49],且需要相对较低的pH环境。NiNOR还能与质膜束缚的 NR相互协调作用,在质外体中还原 NR合成的亚硝酸盐,并认为烟草根中的 NR:NiNOR系统与土壤中可利用硝酸盐的感应有关[50]。

此外,植物过氧化物酶体中的黄嘌呤氧化还原酶也能将亚硝酸盐还原为 NO。XOR有两种可以互换的形式：过氧化物诱导的黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)和黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)[51,52],在豌豆(Pisum sativum L. )叶中XOD约占70%[53],低氧条件下,XOD可将亚硝酸盐还原成NO,而有氧条件下,XOD催化反应的主要产物则是尿酸和过氧化物[54]。

2 植物NO对花发育的调节

2.1 植物NO与开花转换

植物开花是一个受外源环境和内源信号共同调控的过程,复杂而有序的调节系统能确保植物在适宜条件下开花并保证物种的生殖延续。以往对植物成花机制的研究主要集中在4个成花途径以及花器官决定基因方面,如光周期途径、春化作用途径、赤霉素途径和自主调节途径[1～3]。之后,拟南芥 NO大量合成突变体nox1的成功筛选,发现了NO对开花的抑制作用。He等[10]发现与野生型拟南芥相比,nox1中有更多NO合成底物L-精氨酸和中间产物L-瓜氨酸,NO释放量增加,同时表现为莲座叶数增多和晚花。这些现象无疑加深了人们对开花的理解,同时也增加了开花调控的复杂性。

如图1所示,本文将结合He等[10]和其他的相关研究初步解析 NO抑制开花的分子机制。在拟南芥开花途径中,开花整合因子(Floral pathway integrator),AGAMOUS-LIKE24 (AGL24)、FLOWERING LOCUS T (FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1)等能通过信号传递把各个开花途径的效应聚集到花分生组织决定基因APETALA1(AP1)和LEAFY (LFY)上。AP1和 LFY在开花转换之前表达逐步增加,最终促使植物花芽分化形成[4,55～57]。在光周期途径中,CONSTANS (CO)作为最下游元件,起联系昼夜节律和花分生组织形成的重要作用[58,59]。当昼夜节律中央调控组分TIMING OF CAB EXPRESSION (TOC1) 和 CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1(CCA1)正常表达时,内源NO可抑制昼夜节律到光周期途径的信号传递[60,61],从而使 GIGANTEA(GI)及其下游的 CO基因表达相应减少,CO的低表达使LFY基因表达下调,植株营养生长延长并表现出莲座叶数增加和晚花。通常野生型拟南芥在长日照下正常开花,短日照下晚花,而NO大量合成突变体nox1在长日和短日条件下都表现晚花,且晚花时间比野生型在短日条件下更为延迟[10],进一步证明了NO对开花的抑制作用。

对自主调节途径的研究发现,拟南芥自主调节途径突变体(Autonomous pathway mutants)具有晚花表型的同时,开花抑制基因 FLOWERING LOCUS C(FLC)表达上调[62],并且野生型、突变体 nox1和Atnos1中FLC的表达量多少与它们各自的开花时间的早晚对应一致[59],说明 NO也参与了自主调节途径的调控[63]。由此可见,NO对开花转换的调控作用,除光周期途径外至少还涉及自主调节途径。虽然还不清楚 NO在该途径中抑制开花的详细机制,但可以确定的是,内源 NO可能通过下调自主调节途径组分活性(Activity or expression of autonomous pathway components)或提高一系列促进FLC表达必须因子(A collection of factors required to promote FLC expression)的活性而上调 FLC的表达,最终的效应都作用到开花促进因子LFY上,抑制LFY表达,延迟开花[64]。在随后的研究中发现,硝酸还原酶缺陷双突变体 nia1nia2中不仅内源 NO合成较少,同时表现为茎叶数/莲座叶数比率上升,抽苔和开花时间缩短[11],也说明了NO对开花转化的抑制作用。

图 1 NO 抑制植物开花(根据文献[10,55,57,64,65]整理)

除NO以外,14-3-3蛋白家族也参与到植物开花转换的调控网络中调节植物开花。14-3-3蛋白家族在真核生物多个信号途径中起作用,调节一系列生物应答反应。其信号通路作用最普遍的方式是14-3-3蛋白二聚体与磷酸化的靶蛋白绑定并调节其表达[66]。拟南芥14-3-3蛋白μ和υ在光感应和光应答中具有重要作用,它们与光周期途径中心调控因子CO蛋白结合促进FT的表达[57,67],FT蛋白作为可移动的开花信号‘成花素’中的一个重要组分,能与转录因子FD结合上调花分生组织决定基因AP1从而促进拟南芥开花。但是在水稻(Oryza sativa L.)中,过表达的GF14c(A G-box factor 14-3-3c protein) 蛋白却通过与FT同源基因编码的Hd3a蛋白结合的方式,阻止后者在筛管内和细胞间自由移动,进而抑制水稻开花[68]。另有研究还表明,14-3-3蛋白还与NR的活性密切相关[40,44],它能绑定到磷酸化的 NR酶上,使 NR以依赖 Mg2+和 Ca2+的形式失活和降解[40]。因此,14-3-3蛋白对植物开花转换究竟起促进作用还是抑制作用,以及是否通过调控NR影响NO合成并进而调控植物开花仍不清楚。

综上所述,NO对拟南芥开花起抑制作用,但其开花调控的直接方式和生物学意义仍不很清楚; 另外,NO在光周期和自主调节途径中的具体调控机制也了解甚少,其中NO调控FLC表达涉及的中间作用元件更是个谜; 此外,NO合成还受生物和非生物刺激调节,例如低温和冷冻胁迫、渗透胁迫和病毒侵染都会促使 NO合成[69,70,42],虽然还不清楚这些逆境诱导下的 NO与抑制开花的直接关系,但不排除植物在胁迫条件下通过合成 NO抑制开花,避免在不适条件下繁殖后代的可能性; 最后,NO抑制开花转换是否具有普遍性仍需在其他开花植物中开展验证性研究。

2.2 NO与花粉萌发和花粉管延伸的关系

授粉受精是开花植物有性生殖的基本环节,有活力的花粉粒转移到柱头萌发、花粉管定向生长和花粉雌蕊间相互作用的完成是成功受精和种子形成的必要条件[71,72]。通常具有亲和性的花粉粒被柱头接受,吸水膨胀,内壁经外壁上的萌发孔向外突出形成花粉管。花粉管以一种典型的极性细胞扩增形式延伸,延伸活动几乎专一定位在花粉管顶部并需要大量的蛋白质和多糖来维持质膜和细胞壁的迅速扩张[72,73]。

NO对植物开花转换的抑制效应引起了学者对NO在花发育中作用的兴趣。Seligman等[11]通过对拟南芥花发育过程中NO表达模式的研究,发现NO只在特异组织和细胞中合成且合成量随着花发育进程不断增加直至开花。在nia1nia2双突变体中,NO的合成量虽然大幅减少,但 NO释放模式却没有改变。在四轮花器官中,萼片和花瓣无NO合成,而雌蕊的NO合成仅发生在柱头的乳突上,雄蕊的NO合成也只特异地发生在即将分化为花粉粒的成熟小孢子中,由此可见NO与授粉、花粉粒萌发及花粉管的生长密切相关。对百合(Lilium longiflorum Thunb. )的研究发现,NO对花粉管延伸有重要作用,花粉管顶端的 NO浓度调节着花粉管延伸的速率和方向。在外源高浓度 NO诱导下,花粉管延伸速率降低且生长轴方向发生改变,但随后恢复正常生长[73]。

另有关于NO供体、UV-B和逆境胁迫等方面的研究也表明,NO与花粉萌发和花粉管延伸的作用关系密切。经 S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)和硝普酸钠(Sodium nitroprusside,SNP)等NO供体处理的黄瓜(Cucumis sativus L.),花粉萌发和花粉管延伸表现出一种剂量依赖模式的抑制现象[74]。大多数植物的花粉粒萌发和花粉管延伸可被 UV-B抑制,UV-B的作用机理似乎也涉及到NO的信号传递[75～77],如萌发的紫花泡桐(Paulownia tomentosa(Thunb.) Steud. )花粉暴露在UV-B下能提高NO的合成量[77]。虽然 NO清除剂 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazole-1-oxyl 3-oxide (cPTIO)和动物NOS抑制剂L-NAME对花粉萌发和花粉管延伸都无明显作用,但这些物质却能部分解除UV-B、GSNO和SNP对花粉萌发和花粉管延伸的抑制作用。此外,这些抑制效应还能被可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂阻断,表明在 NO抑制花粉和花粉管延伸的信号通路中有环鸟苷酸(Cyclic guanosine monophosphate,cGMP)参与[74]。例如,百合花的花粉管延伸和茶树受低温抑制的花粉萌发与花粉管延伸均涉及cGMP信号途径[73,78,79]。

综上所述,NO供体、UV-B和低温胁迫等促使花粉粒和花粉管中 NO的大量合成,NO信号经由cGMP途径传导,最后抑制花粉萌发和花粉管延伸并调节花粉管的延伸方向。另有研究表明,野生型拟南芥花粉管延伸到离胚珠孔约10μm处会重新调整延伸方向进入胚珠[80],由于缺乏既不损伤胚珠又能准确测定胚珠 NO含量的技术,所以花粉管调整方向进入胚珠是否与 NO合成量有关仍需进一步研究[73]。

3 结语与展望

NO作为重要的信号分子,参与了植物生长发育的多个过程,但植物内源 NO合成的确切机制仍不是很清楚。虽然普遍认为植物 NOS基因与动物NOS基因存在一定的同源性,且在植物中也能检测到NOS-Like活性,但目前仍未发现植物特有的NOS基因或依赖 L-精氨酸的 NO合成途径,这就极大地限制了植物 NO信号通路的研究。因此,寻找植物“NOS基因”仍是一个极具挑战性的有和意义的课题。鉴于动植物的差异,在基于动物NOS进行类比研究时应当建立更合理的模型和方法,其中生物信息学和基因组学的进展有可能对植物NOS基因的寻找带来一定的帮助。

植物花发育涉及众多基因表达和信号传导途径,内源 NO的参与无疑增加了成花转变和花发育调控的复杂性。这既加深了对花发育的理解,也提醒人们用更加系统宏观的理念研究NO信号通路。显然,目前对 NO信号在花发育过程中的调控机制还了解甚少,例如开花转换中 NO对光周期途径和自主调节途径的具体作用机制并不清楚; NO在花发育过程中的直接作用靶和 NO信号通路中关键次级信使分子的鉴定也亟需解决; 在花粉萌发和花粉管延伸中,NO作用涉及的信号途径也需要进一步研究等。今后随着植物 NO合成途径的深入研究,必将推动植物花发育过程中 NO调控机制的进一步揭示,也会促进和加深人们对植物开花过程的解读。

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