新一代测序技术在遗传性耳聋基因研究及诊断中的应用

袁慧军，卢宇

解放军总医院耳鼻咽喉研究所，北京 100853

耳聋(Hearing loss)是人类最常见的感觉神经系统缺陷，根据2006年第二次全国残疾人抽样调查报告，我国听力残疾者有2780万人，占残疾人总数的33.51%，其中0～6岁听障儿童达13.9万，每年新生聋儿 2～3万[1]。我国 2008～2010年先天性听力障碍发生率分别为1.99‰、2.15‰ 和2.19‰，呈逐年上升趋势[2]。随着年龄增长，由于遗传因素和环境因素的共同作用，人群中的耳聋患病率也相应增加。遗传性耳聋(Hereditary hearing loss)在感音神经性聋患者中超过 50%，随着国民生活水平和医疗保健水平的提高，致聋环境因素得到有效控制，遗传因素逐渐成为耳聋的主要致病原因。

病因学研究是疾病预防和治疗的基础。遗传性耳聋的系统性研究，使我们能从较深层次理解耳聋发生的病因及病理机制，为耳聋的分子遗传学诊断、预防乃至治疗提供新的方法。人类基因组学研究，特别是功能基因组学研究的成果，将为遗传性耳聋的防治带来巨大的裨益。近20年来遗传性耳聋的研究取得了飞速发展，分子遗传学诊断在临床诊断和新生儿听力基因联合筛查中得到大量应用，但是仍有大多数遗传性耳聋无法明确病因，即使对已知耳聋基因的研究也未完全阐明其致病机理。

2005年问世、2008年在全球普及的高通量测序技术，又称“新一代测序”技术引发了疾病致病基因研究的革命，掀起了一场以发现遗传疾病致病基因和基因功能研究为核心的学术热潮。高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里程碑，它可以并行对几百万个DNA分子同时测序，通过寻找突变位点鉴定遗传性疾病的致病基因。新一代测序技术被多个机构探索用于临床检测，国内外多家公司已推出基于新一代测序技术的遗传性耳聋基因检测产品。全基因组测序、全外显子组测序和大规模平行测序的发展，大力推动了遗传性耳聋的基因研究和基因诊断的技术进步。

1 遗传性耳聋的特点及研究现状

遗传性耳聋基因研究主要任务是鉴定致病基因突变，阐明分子致病机制，为临床诊断、治疗和预防提供新的方法和遗传咨询指导。耳聋具有高度遗传异质性，以耳聋为唯一症状的非综合征型耳聋占所有遗传性耳聋的70%，而综合征型耳聋占30%。大部分的非综合征型耳聋符合孟德尔遗传方式，即单基因突变导致耳聋，按照遗传方式分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X染色体连锁和线粒体母系遗传，分别占非综合征型遗传性耳聋的15%、80%、1%和～4%。据估计遗传性耳聋的致病基因超过600个，目前已明确的非综合征型耳聋基因超过70个，综合征型耳聋基因超过150个，仍有大量的遗传性耳聋致病基因还不明确。在耳聋人群中，常见致聋基因 GJB2、SLC26A4和线粒体 DNA 12S rRNA A1555G突变导致的耳聋病例占 30%～40%左右，其他单个致聋基因突变的遗传负荷相对较低。高度的遗传异质性给遗传性耳聋临床基因诊断带来极大挑战。耳聋基因的突变类型多样，包括点突变、小片段插入缺失(Indel)、拷贝数变异(Copy number variation，CNV)、结构变异(Structural variation，SV)等，单一检测技术难以奏效，检测出的许多耳聋基因遗传变异的致病性也还不完全清楚。

在NGS技术问世前，传统的耳聋基因研究主要采用定位克隆策略，包括功能克隆、位置克隆、候选基因克隆、位置候选基因克隆等，功能克隆和位置克隆受限于耳聋基因功能研究、耳聋家系和群体研究等客观困难，采用较多的方法是候选基因克隆和位置候选基因克隆。候选基因克隆在常见综合征型耳聋中应用较多，非综合征型耳聋由于表型差异小，大多难以通过表型特征确定候选基因。Hildebrand等[3]曾报道应用 DFNA表型特征数据库通过特定的算法预测常染色体显性遗传耳聋致病基因，但适用范围较小。位置候选基因克隆是过去20年来发现耳聋新基因最有效的方法，主要应用连锁分析进行耳聋家系致病基因的染色体定位，在定位区域内根据基因功能、表达信息等选择合适的基因进行克隆和突变检测。特别是近10年来人类基因组计划的完成和高通量全基因组SNP分型技术的应用，加速了耳聋新基因的发现进程。但是目前的研究策略仍有很多不足[4]，随着基因组学研究和新一代测序技术的进步，耳聋基因研究和基因诊断正步入一个新的高速发展阶段。

绝大多数的遗传性耳聋由单基因突变导致，在先天性耳聋中遗传因素占主导地位，其中主要是单个基因双等位基因突变导致[5]。临床分子诊断可以提供准确的表型预测，特别是对新生儿基因型筛查可以对听力状况进行及早诊断以便早期干预[6]。根据群体分子流行病调查数据，国际上很多实验室建立了常见耳聋基因的筛查方法，Sanger测序是临床分子诊断的金标准，但是检测效率低、成本高，传统的酶切、杂交、TaqMan探针等方法针对突变热点进行检测，在检测通量上仍然没有大幅度提高。近几年微阵列芯片的技术进步极大提高了诊断效率，降低了检测成本。通过CFDA认证的博奥耳聋基因检测芯片在特殊群体和新生儿耳聋基因筛查和临床耳聋基因诊断中发挥了一定的作用。国外报道的APEX、Invader等芯片检测技术，可以同时针对数百个突变位点进行高通量检测，但检测周期最长可达8周，而且检测成本相对较高，对除点突变之外的其他突变类型的检出能力有限(表1)[7～17]。

表1 国内外耳聋基因检测芯片

2 新一代测序技术在遗传性疾病基因研究中的发展历程

利用 NGS技术鉴定单基因遗传病的致病基因已逐步发展形成了一整套行之有效的研究方法体系，即第一步，收集家系样本；第二步，选择部分样本进行基因组扫描(全基因组重测序、全外显子组测序、疾病相关基因大规模平行测序、目标区域测序等)；第三步，利用生物信息学分析筛选候选基因；第四步，在大规模病例和对照样本中验证突变；第五步，在分子、细胞、模式动物水平上进行基因功能验证及致病机制研究。

全外显子测序技术是一种新型的基因组分析技术，与传统技术相比，具有简便、经济、准确、高效的优点，为单基因病的研究带来了重大突破，现已成为单基因病研究最有效的方法。针对较大的遗传家系，选择几个样本进行全外显子组测序及生物信息学分析，通常可以得到几十个候选基因突变，在整个家系进行分离分析后即可找出致病基因。对于大量散发病例的研究，可以借用家系样本的研究思路，扩大样本量进行全外显子组测序分析，通过分析患病个体同正常个体的差异，可以找出在人群中遗传负荷较高的致病基因。在人体中，DNA、RNA、蛋白质组成了一个复杂的网络，在进行疾病研究时，有必要结合各种技术，多个层面分析疾病的致病机理，系统地阐释疾病发生的原因。因此，在通过外显子测序技术对疾病进行研究的同时，还需要考虑从转录组学、蛋白组学进行联合分析，从而系统地描绘出疾病的致病机理和遗传特点。

通常与某种遗传性疾病相关的致病基因有几个到几百个不等，疾病相关基因大规模平行测序是指将几个或几百个与某种遗传性疾病相关的致病基因的全部外显子序列进行捕获，然后富集捕获到的序列进行高通量测序。很多人类疾病都与特定的基因相关，所以对这些基因集进行测序，找出基因变异，分析致病的机理，在理解人类的疾病进程中尤为重要。与外显子测序相比，疾病相关基因大规模平行测序加入了特定的非编码区域测序，非编码区由于其对基因表达具有调控作用，越来越受到研究者的重视。由于疾病相关基因大规模平行测序的高效性以及寻找特定基因集变异的全面性，近年来也成为鉴定致病基因的主流技术。

通过连锁分析，研究人员通常可以把候选致病基因定位在染色体的某个区段，对该候选区域进行富集，然后将这些富集的目标区域进行测序。常见的目标区域富集的方法有芯片杂交捕获(On-array hybrid capture)和液相捕获(In-solution hybrid cap-ture)、PCR、分子倒位探针(Molecular inversion probes，MIP)等。由于测序的目标区域只占全基因组的一小部分，目标区域测序能够达到很高的测序深度。目前常用商业化目标区域测序，其目标区域大小可从2 Mb到60 Mb不等，大多数目标区域在小于10 Mb的情况下利用生物编码(Barcode)技术将多个样品混合后测序，一次测序可以获得多个样品足够测序深度的数据。目标区域测序主要包括目标区域的捕获富集、DNA短片段测序、生物信息学分析3个主要步骤。目标区域捕获技术主要包括以NimbleGen为代表的固相靶向序列捕获系统和以 SureSelect为代表的液相靶向序列捕获系统[18,19]，两种方法具有高准确性、高特异性、高覆盖度和卓越的可重复性，而且可以按需设计、定制方便，在NGS应用中取得了广泛的应用[20]。NimbleGen技术的大致流程是将打断的基因组DNA片段与定制的芯片杂交，洗去未杂交的DNA片段，将捕获的目标片段洗脱扩增，再进行高通量测序；SureSelect则是基于寡核苷酸合成技术，将打断后的基因组DNA片段与RNA诱饵共同孵育，通过含有链酶亲和素标记的磁珠钓出与诱饵结合的DNA片段，洗脱磁珠并降解诱饵，富集目的片段后进行高通量测序。目前常用的新一代测序的原理是边合成边测序，即将打断的基因组DNA片段两侧连接接头序列，用不同的方法产生数百万个空间固定的单克隆簇，所有单克隆同时独立进行引物结合和酶延伸，实时拍摄每个延伸掺入的荧光信号获取测序数据，目前广泛使用的Solexa测序仪和SOLiD测序仪均基于这样的合成测序原理；Ion Torrent测序仪应用半导体测序原理，通过专有的大规模并行芯片感应器检测密布于半导体芯片上的微反应孔内的pH值变化，孔内微珠上的基因组DNA片段能够与互补的碱基结合释放氢离子，通过电信号的检测可以判断碱基的类型从而获得序列信息；SMRT是更新一代的测序仪，不需要扩增建立DNA库，通过合成互补链对单个DNA分子片段直接进行测序。

3 新一代测序技术在耳聋基因研究和诊断中的应用

2010年3月，Rehman等[21]报道了第一个应用NGS技术鉴定的耳聋新基因，该研究利用NimbleGen芯片捕获技术结合454测序平台，对应用连锁分析方法定位于DFNB79位点2.9 Mb区域的家系DNA样品进行目标区域测序，发现TPRN基因纯合无义突变，Sanger测序验证确定在家系内共分离，在其他3个DFNB79家系中进行TPRN基因测序，发现了3个移码突变为其致病原因。应用类似的连锁分析结合目标区域测序策略，Sirmaci等[22]在1个土耳其综合征型耳聋家系中鉴定了 MASP1基因致病突变在家系中与表型共分离，并在另一个患有相同综合征的家系中应用Sanger测序鉴定了MASP1基因另一个致病突变。Huebner等[23]报道了对2个DFNX4家系的连锁分析定位区域进行目标区域测序，发现了一个新的 X-连锁非综合征型耳聋(DFNX)基因SMPX。传统连锁分析定位策略对参与研究家系的患者数量有较高的要求，随着 NGS成本的快速下降，全外显子组测序逐渐成为目前鉴定耳聋新基因的主要策略，特别是对于罕见的综合征型耳聋，可以通过数量有限的患者鉴定出致病基因(表2)[21～43]。

NGS技术巨大的优越性使其被迅速应用到临床实践中，2010年 Shearer等[44]在 PNAS上首先报道了针对 54个已知非综合征型耳聋基因进行大规模平行测序的可行性。他们在目标区域捕获中使用了NimbleGen芯片捕获和SureSelect液相捕获技术，测序系统分别选择了454和Illumina测序仪。生物信息学分析利用自建的分析流程和参数设置，整合了致病性预测软件 SIFT、BLOSUM、Polyphen2、Align-GVGD等。在6例先天性耳聋患者中鉴定出了其中 5例致病基因突变。他们认为目标区域测序技术对于耳聋的分子遗传学诊断具有足够的敏感性、特异性和可重复性。

2011年Brownstein等[45]报道了利用寡核苷酸探针捕获85个人类耳聋基因和161个小鼠耳聋基因，患者基因组DNA经过生物编码混合后应用Illumina测序平台进行配对末端测序。所有样品目标区域测序深度中位数在757～2080之间，95%的目标区域测序深度>10×。在参与研究的 11个中东地区家系中鉴定了其中6个家系在CDH23、MYO15A、TECTA、TMC1和WFS1基因上的致病突变。

2012年Tang等[46]报道了应用成本更低的cDNA探针捕获84个已知耳聋基因，46个患者基因组DNA经过生物编码混合后应用 Illumina测序平台进行测序，平均测序深度263，其中86.4%的目标区域测序深度>100×。

表2 应用新一代测序技术发现的耳聋新基因

在群体遗传背景较为相似的东亚人群中，2012年Baek等[47]首先报道了在8个韩国家系中以80个已知耳聋基因为目标区域的大规模平行测序研究，在5个耳聋家系中分别鉴定了5个不同的致病基因；2012年Mutai等[48]报道针对15个日本家系的58个耳聋患者，应用84个已知耳聋基因的大规模平行测序技术，鉴定了其中7个家系的致病基因；2012年Yang等[49]在190例耳聋患者中通过中国人群常见耳聋基因Sanger测序筛查，确诊了其中65例患者的致病突变，其余患者进行了79个已知耳聋基因大规模平行测序研究，确诊了另外 33例患者的基因缺陷，他们认为对散发病例在大规模平行测序之前进行常见耳聋基因突变筛查对发现新的耳聋基因会更有效率。

4 基于 NGS技术的耳聋基因研究和基因诊断技术发展方向

传统的通过连锁分析定位克隆耳聋基因的研究策略不适于大量的耳聋散发病例和小家系的研究，特别是对一些罕见的综合征型耳聋。通过对遗传性耳聋的研究，特别是孟德尔遗传方式耳聋的致病基因鉴定，可以为我们揭示复杂性耳科疾病提供线索。老年性聋和噪声性聋的家族聚集性一直因其患者数量的限制无法进行连锁分析定位，新一代测序技术则可以通过有限的病例进行致病基因的鉴定；高通量低成本的大规模平行测序可以在大量的散发老年性聋和噪声性聋病例中对已知耳聋基因进行筛查，筛选群体中的易感基因型。

大规模平行测序的临床分子诊断应用已经成为转化医学的前沿，遗传性耳聋的分子诊断、无创产前诊断等也将是大规模平行测序应用的重要领域。除了测序技术的进步，临床分子诊断更依赖于生物信息学分析，特别是基因型与表型的相互关联。大规模平行测序改变了逐个基因测序的模式，也将提供更全面的遗传信息，改变遗传咨询的方式[50]。例如在非综合征型耳聋患者中通过大规模平行测序发现了 CACNA1D基因突变，则提示需要补充心血管系统检查，以明确是否是合并了感音神经性聋和窦房结异常的 SANDD 综合征(OMIM：614896)[51]。Meng等[52]应用目标区域测序技术进行了遗传性耳聋无创产前诊断的探索，该研究通过临床分子遗传学诊断确诊先证者为GJB2基因复合杂合突变致聋，对家族中3代成员进行了超过100 Mb的目标区域高通量测序，获得了包括 GJB2基因外显子区域和超过10万个tag-SNP的序列信息，根据测序结果获得家族成员目标区域的单倍型，再通过母体外周静脉血游离DNA的高通量测序推定胎儿的基因型，预测相关联的听力学表型，该研究开辟了遗传性耳聋无创产前诊断的新发展方向。

遗传性耳聋新基因的发现总是伴随着听觉功能研究新的进展，而基因功能的研究同样为鉴定耳聋基因提供新的线索。随着越来越多的耳聋基因功能和基因突变病理机制的研究进展，内耳毛细胞机械换能机制、钙离子转运代谢等听觉生理通路得到充分阐释，听神经病、低频听力下降等特殊表型的分子机制也获得了初步的揭示。新一代测序技术和生物信息学的发展，不仅加速了新基因的发现，在新基因发现和基因功能研究之间也建立了新的桥梁。Oellrich等[53]报道了利用人类和小鼠表型数据库以及相关的基因功能数据库，以耳聋为例通过表型数据的类比，进行候选基因的筛选和功能分析。Accetturo等[54]报道了根据已知非综合征型耳聋基因功能利用 Semantic Similarity Measure(SSM)功能评分，筛选候选耳聋基因，并利用人类和小鼠表达数据库、GO数据库等进行候选耳聋基因的功能分析。目前已经有几十种软件和算法可以进行关联基因的功能分析和候选基因的预测，例如 Endeavour、GeneRECQuest、ACGR、PDG-ACE 等[55～58]，这些新的生物信息学工具，不仅可以在新一代测序数据分析中辅助筛选，随着耳聋基因研究相关数据的增长，也将在耳聋基因功能研究中发挥重要作用。

高通量测序技术的飞速发展使发现所有耳聋基因变成了可以实现的目标,大规模耳聋基因平行测序技术的开发和应用为临床耳聋基因诊断带来了革命性的发展机遇。大规模耳聋基因平行测序技术不仅在检测成本和检测周期上优于全基因组测序，数据分析也能根据比较完善的基因型与表型关联数据库迅速发现具有重要价值的信息。主要以编码序列为目标区域的大规模平行测序技术也存在一些不足之处：(1)不论哪一种捕获技术，在目标区域捕获时都存在偏倚，尽管增加测序深度可以一定程度弥补偏倚，但是仍有部分区域难以捕获；(2)大规模平行测序对基因组结构变异的检测具有局限性，通过增加测序深度和改进数据分析算法已经显著提高了CNV和 indel的检测能力，但其灵敏度和特异度仍然低于点突变的检测；(3)大多数非编码序列和表观遗传学的修饰尚无法应用该技术检出，可能因此存在一定的假阴性结论，但是其变异对疾病的影响仍难以评价；(4)该技术获得的检测结果仍然需要通过基因分型、Sanger测序等方法进行验证，这些验证增加了检测耗时和成本，因此需要提高数据分析的效率；(5)在大量的检出数据中仍有SNV未确定是否与耳聋相关，即使在已知耳聋基因中，也有部分SNV的致病性尚存争议，不同人种的遗传背景差异也使得SNV致病性的判定需要更加大量的数据和详尽的分析。

由于耳聋基因研究和临床基因诊断所面临的巨大挑战，中国的科学家们在过去的几年中建立了一整套高效率低成本的耳聋基因变异自有检测技术，并联手成立了“中国遗传性耳聋基因研究战略联盟”，目前正致力于建立大规模的中国耳聋人群基因变异数据库，优化 NGS数据分析策略，提高分析效率，将研究人员从海量NGS数据处理的沉重负担中解放出来，建立适用于中国人群耳聋基因大规模平行测序诊断流程，通过大样本的测序发现和弥补大规模平行测序的不足，为今后耳聋基因研究和临床基因诊断的发展和完善提供可靠的技术保证。可以预见，未来十年基于NGS技术的耳聋基因研究和临床基因诊断技术的发展中国将走在世界的前列。

[1]孙喜斌, 于丽玫, 曲成毅, 梁巍, 王琦, 魏志云.中国听力残疾构成特点及康复对策.中国听力语言康复科学杂志, 2008, (2): 21–24.

[2]中华人民共和国卫生部.中国出生缺陷防治报告.2012.

[3]Hildebrand MS, DeLuca AP, Taylor KR, Hoskinson DP,Hur IA, Tack D, McMordie SJ, Huygen PLM, Casavant TL, Smith RJH.A contemporary review of AudioGene audioprofiling: a machine-based candidate gene prediction tool for autosomal dominant nonsyndromic hearing loss.Laryngoscope, 2009, 119(11): 2211–2215.

[4]Botstein D, Risch N.Discovering genotypes underlying human phenotypes: past successes for mendelian disease,future approaches for complex disease.Nat Genet, 2003,33(Suppl): 228–237.

[5]Hilgert N, Smith RJH, Van Camp G.Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: which ones should be analyzed in DNA diagnostics? Mutat Res, 2009, 681(2–3):189–196.

[6]Robin NH, Prucka SK, Woolley AL, Smith RJH.The use of genetic testing in the evaluation of hearing impairment in a child.Curr Opin Pediatr, 2005, 17(6): 709–712.

[7]http://www.capitalbio.com.

[8]http://www.geneskies.com.

[9]http://www.bgidiagnosis.cn.

[10]Gardner P, Oitmaa E, Messner A, Hoefsloot L, Metspalu A,Schrijver I.Simultaneous multigene mutation detection in patients with sensorineural hearing loss through a novel diagnostic microarray: a new approach for newborn screening follow-up.Pediatrics, 2006, 118(3): 985–994.

[11]Rodriguez-Paris J, Pique L, Colen T, Roberson J, Gardner P, Schrijver I.Genotyping with a 198 mutation arrayed primer extension array for hereditary hearing loss: assessment of its diagnostic value for medical practice.PLoS ONE, 2010, 5(7): e11804.

[12]Siemering K, Manji SSM, Hutchison WM, Du Sart D,Phelan D, Dahl HHM.Detection of mutations in genes associated with hearing loss using a microarray-based approach.J Mol Diagn, 2006, 8(4): 483–489; quiz 528.

[13]Kothiyal P, Cox S, Ebert J, Husami A, Kenna MA,Greinwald JH, Aronow BJ, Rehm HL.High-throughput detection of mutations responsible for childhood hearing loss using resequencing microarrays.BMC Biotechnol,2010, 10: 10.

[14]http://www.cgcgenetics.com.

[15]Abe S, Yamaguchi T, Usami SI.Application of deafness diagnostic screening panel based on deafness mutation/gene database using invader assay.Genet Test, 2007, 11(3):333–340.

[16]Lim BG, Clark RH, Kelleher AS, Lin ZL, Spitzer AR,Pediatrix SoundGene® Study Group Principal Investigators and Contributors.Utility of genetic testing for the detection of late-onset hearing loss in neonates.Am J Audiol, 2013,22(2): 209–215.

[17]http://www.pediatrix.com.

[18]Gnirke A, Melnikov A, Maguire J, Rogov P, LeProust EM,Brockman W, Fennell T, Giannoukos G, Fisher S, Russ C,Gabriel S, Jaffe DB, Lander ES, Nusbaum C.Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing.Nat Biotechnol,2009, 27(2): 182–189.

[19]Kahvejian A, Quackenbush J, Thompson JF.What would you do if you could sequence everything? Nat Biotechnol,2008, 26: 1125–1133.

[20]Clark MJ, Chen R, Lam HYK, Karczewski KJ, Chen R,Euskirchen G, Butte AJ, Snyder M.Performance comparison of exome DNA sequencing technologies.Nat Biotechnol,2011, 29: 908–914.

[21]Rehman AU, Morell RJ, Belyantseva IA, Khan SY, Boger ET, Shahzad M, Ahmed ZM, Riazuddin S, Khan SN,Riazuddin S, Friedman TB.Targeted capture and nextgeneration sequencing identifies C9orf75, encoding taperin,as the mutated gene in nonsyndromic deafness DFNB79.Am J Hum Genet, 2010, 86(3): 378–388.

[22]Sirmaci A, Walsh T, Akay H, Spiliopoulos M, Sakalar YB,Hasanefendioğlu-Bayrak A, Duman D, Farooq A, King MC, Tekin M.MASP1 mutations in patients with facial,umbilical, coccygeal, and auditory findings of Carnevale,Malpuech, OSA, and Michels syndromes.Am J Hum Genet, 2010, 87(5): 679–686.

[23]Huebner AK, Gandia M, Frommolt P, Maak A, Wicklein EM, Thiele H, Altmuller J, Wagner F, Viñuela A, Aguirre LA, Moreno F, Maier H, Rau I, Gießelmann S, Nürnberg G, Gal A, Nürnberg P, Hübner CA, del Castillo I, Kurth I.Nonsense mutations in SMPX, encoding a protein responsive to physical force, result in X-chromosomal hearing loss.Am J Hum Genet, 2011, 88(5): 621–627.

[24]Xing GQ, Yao J, Wu B, Liu TT, Wei QJ, Liu C, Lu YJ,Chen ZB, Zheng H, Yang XN, Cao X.Identification of OSBPL2 as a novel candidate gene for progressive nonsyndromic hearing loss by whole-exome sequencing.Genet Med, 2014, DOI: 10.1038/gim.2014.90.

[25]Zheng J, Miller KK, Yang T, Hildebrand MS, Shearer AE,DeLuca AP, Scheetz TE, Drummond J, Scherer SE, Legan PK, Goodyear RJ, Richardson GP, Cheatham MA, Smith RJ, Dallos P.Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 16 interacts with α-tectorin and is mutated in autosomal dominant hearing loss (DFNA4).Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(10): 4218–4223.

[26]Behlouli A, Bonnet C, Abdi S, Bouaita A, Lelli A,Hardelin JP, Schietroma C, Rous Y, Louha M, Cheknane A,Lebdi H, Boudjelida K, Makrelouf M, Zenati A, Petit C.EPS8, encoding an actin-binding protein of cochlear hair cell stereocilia, is a new causal gene for autosomal recessive profound deafness.Orphanet J Rare Dis, 2014, 9: 55.

[27]Santos-Cortez RLP, Lee K, Giese AP, Ansar M, Amin-Ud-Din M, Rehn K, Wang X, Aziz A, Chiu I, Hussain Ali R, Smith JD, University of Washington Center for Mendelian Genomics, Shendure J, Bamshad M, Nickerson DA,Ahmed ZM, Ahmad W, Riazuddin S, Leal SM.Adenylate cyclase 1 (ADCY1) mutations cause recessive hearing impairment in humans and defects in hair cell function and hearing in zebrafish.Hum Mol Genet, 2014, 23(12): 3289–3298.

[28]Girotto G, Abdulhadi K, Buniello A, Vozzi D, Licastro D,d'Eustacchio A, Vuckovic D, Alkowari MK, Steel KP,Badii R, Gasparini P.Linkage study and exome sequencing identify a BDP1 mutation associated with hereditary hearing loss.PLoS ONE, 2013, 8(12): e80323.

[29]Walsh T, Shahin H, Elkan-Miller T, Lee MK, Thornton AM, Roeb W, Abu Rayyan A, Loulus S, Avraham KB,King MC, Kanaan M.Whole exome sequencing and homozygosity mapping identify mutation in the cell polarity protein GPSM2 as the cause of nonsyndromic hearing loss DFNB82.Am J Hum Genet, 2010, 87(1): 90–94.

[30]Rehman AU, Santos-Cortez RLP, Morell RJ, Drummond MC, Ito T, Lee K, Khan AA, Basra MAR, Wasif N, Ayub M, Ali RA, Raza SI, University of Washington Center for Mendelian Genomics, Nickerson DA, Shendure J, Bamshad M, Riazuddin S, Billington N, Khan SN, Friedman PL,Griffith AJ, Ahmad W, Riazuddin S, Leal SM, Friedman TB.Mutations in TBC1D24, a gene associated with epilepsy,also cause nonsyndromic deafness DFNB86.Am J Hum Genet, 2014, 94(1): 144–152.

[31]Jaworek TJ, Richard EM, Ivanova AA, Giese APJ, Choo DI, Khan SN, Riazuddin S, Kahn RA, Riazuddin S.An alteration in ELMOD3, an Arl2 GTPase-activating protein,is associated with hearing impairment in humans.PLoS Genet, 2013, 9(9): e1003774.

[32]Santos-Cortez RLP, Lee K, Azeem Z, Antonellis PJ,Pollock LM, Khan S, Irfanullah, Andrade-Elizondo PB,Chiu I, Adams MD, Basit S, Smith JD, University of Washington Center for Mendelian Genomics, Nickerson DA, McDermott BM Jr, Ahmad W, Leal SM.Mutations in KARS, encoding lysyl-tRNA synthetase, cause autosomalrecessive nonsyndromic hearing impairment DFNB89.Am J Hum Genet, 2013, 93(1): 132–140.

[33]Delmaghani S, Aghaie A, Michalski N, Bonnet C, Weil D,Petit C.Defect in the gene encoding the EAR/EPTP domain-containing protein TSPEAR causes DFNB98 profound deafness.Hum Mol Genet, 2012, 21(17): 3835–3844.

[34]Imtiaz A, Kohrman DC, Naz S.A frameshift mutation in GRXCR2 causes recessively inherited hearing loss.Hum Mutat, 2014, 35(5): 618–624.

[35]Rost S, Bach E, Neuner C, Nanda I, Dysek S, Bittner RE,Keller A, Bartsch O, Mlynski R, Haaf T, Müller CR,Kunstmann E.Novel form of X-linked nonsyndromic hearing loss with cochlear malformation caused by a mutation in the type IV collagen gene COL4A6.Eur J Hum Genet,2014, 22(2): 208–215.

[36]Schraders M, Haas SA, Weegerink NJD, Oostrik J, Hu H,Hoefsloot LH, Kannan S, Huygen PLM, Pennings RJE,Admiraal RJC, Kalscheuer VM, Kunst HPM, Kremer H.Next-generation sequencing identifies mutations of SMPX,which encodes the small muscle protein, X-linked, as a cause of progressive hearing impairment.Am J Hum Genet, 2011, 88(5): 628–634.

[37]Pierce SB, Walsh T, Chisholm KM, Lee MK, Thornton AM, Fiumara A, Opitz JM, Levy-Lahad E, Klevit RE, King MC.Mutations in the DBP-deficiency protein HSD17B4 cause ovarian dysgenesis, hearing loss, and ataxia of Perrault Syndrome.Am J Hum Genet, 2010, 87(2): 282–288.

[38]Jenkinson EM, Rehman AU, Walsh T, Clayton-Smith J,Lee K, Morell RJ, Drummond MC, Khan SN, Naeem MA,Rauf B, Billington N, Schultz JM, Urquhart JE, Lee MK,Berry A, Hanley NA, Mehta S, Cilliers D, Clayton PE,Kingston H, Smith MJ, Warner TT, University of Washington Center for Mendelian Genomics, Black GC,Trump D, Davis JRE, Ahmad W, Leal SM, Riazuddin S,King MC, Friedman TB, Newman WG.Perrault syndrome is caused by recessive mutations in CLPP, encoding a mitochondrial ATP-dependent chambered protease.Am J Hum Genet, 2013, 92(4): 605–613.

[39]Pierce SB, Gersak K, Michaelson-Cohen R, Walsh T, Lee MK, Malach D, Klevit RE, King MC, Levy-Lahad E.Mutations in LARS2, encoding mitochondrial leucyl-tRNA synthetase, lead to premature ovarian failure and hearing loss in Perrault syndrome.Am J Hum Genet, 2013, 92(4):614–620.

[40]Pierce SB, Chisholm KM, Lynch ED, Lee MK, Walsh T,Opitz JM, Li WQ, Klevit RE, King MC.Mutations in mitochondrial histidyl tRNA synthetase HARS2 cause ovarian dysgenesis and sensorineural hearing loss of Perrault syndrome.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(16):6543–6548.

[41]Klein CJ, Botuyan MV, Wu YH, Ward CJ, Nicholson GA,Hammans S, Hojo K, Yamanishi H, Karpf AR, Wallace DC, Simon M, Lander C, Boardman LA, Cunningham JM,Smith GE, Litchy WJ, Boes B, Atkinson EJ, Middha S, B Dyck PJ , Parisi JE, Mer G, Smith DI, Dyck PJ.Mutations in DNMT1 cause hereditary sensory neuropathy with dementia and hearing loss.Nat Genet, 2011, 43(6): 595–600.

[42]Ng BG, Hackmann K, Jones MA, Eroshkin AM, He P,Wiliams R, Bhide S, Cantagrel V, Gleeson JG, Paller AS,Schnur RE, Tinschert S, Zunich J, Hegde MR, Freeze HH.Mutations in the glycosylphosphatidylinositol gene PIGL cause CHIME syndrome.Am J Hum Genet, 2012, 90(4):685–688.

[43]Yuan YY, Zhang JG, Chang Q, Zeng J, Xin F, Wang JJ,Zhu QY, Wu J, Lu JQ, Guo WW, Yan XK, Jiang H, Zhou BF, Li Q, Gao X, Yuan HJ, Yang SM, Han DY, Mao ZX,Chen P, Lin X, Dai P.De novo mutation in ATP6V1B2 impairs lysosome acidification and causes dominant deafness-onychodystrophy syndrome.Cell Res, 2014, DOI:10.1038/cr.2014.77.

[44]Shearer AE, DeLuca AP, Hildebrand MS, Taylor KR,Gurrola J, 2nd, Scherer S, Scheetz TE, Smith RJ.Comprehensive genetic testing for hereditary hearing loss using massively parallel sequencing.Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(49): 21104–21109.

[45]Brownstein Z, Friedman LM, Shahin H, Oron-Karni V,Kol N, Abu Rayyan A, Parzefall T, Lev D, Shalev S,Frydman M, Davidov B, Shohat M, Rahile M, Lieberman S, Levy-Lahad E, Lee MK, Shomron N, King MC, Walsh T, Kanaan M, Avraham KB.Targeted genomic capture and massively parallel sequencing to identify genes for hereditary hearing loss in Middle Eastern families.Genome Biol,2011, 12(9): R89.

[46]Tang WX, Qian D, Ahmad S, Mattox D, Todd NW, Han H,Huang ST, Li YH, Wang YF, Li HW, Lin X.A low-cost exon capture method suitable for large-scale screening of genetic deafness by the massively-parallel sequencing approach.Genet Test Mol Biomarkers, 2012, 16(6): 536–542.

[47]Baek JI, Oh SK, Kim DB, Choi SY, Kim UK, Lee KY, Lee SH.Targeted massive parallel sequencing: the effective detection of novel causative mutations associated with hearing loss in small families.Orphanet J Rare Dis, 2012, 7: 60.

[48]Mutai H, Suzuki N, Shimizu A, Torii C, Namba K,Morimoto N, Kudoh J, Kaga K, Kosaki K, Matsunaga T.Diverse spectrum of rare deafness genes underlies early-childhood hearing loss in Japanese patients: a cross-sectional,multi-center next-generation sequencing study.Orphanet J Rare Dis, 2013, 8: 172.

[49]Yang T, Wei XM, Chai YC, Li L, Wu H.Genetic etiology study of the non-syndromic deafness in Chinese Hans by targeted next-generation sequencing.Orphanet J Rare Dis,2013, 8: 85.

[50]Rehm HL.Disease-targeted sequencing: a cornerstone in the clinic.Nat Rev Genet, 2013, 14(4): 295–300.

[51]Baig SM, Koschak A, Lieb A, Gebhart M, Dafinger C,Nürnberg G, Ali A, Ahmad I, Sinnegger-Brauns MJ,Brandt N, Engel J, Mangoni ME, Farooq M, Khan HU,Nürnberg P, Striessnig J, Bolz HJ.Loss of Cav1.3(CACNA1D) function in a human channelopathy with bradycardia and congenital deafness.Nat Neurosci, 2011,14: 77–84.

[52]Meng M, Li XC, Ge HJ, Chen F, Han MY, Zhang YY,Kang DY, Xie WW, Gao ZY, Pan XY, Dai P, Chi FL, Chen SP, Liu P, Zhang CL, Cao JJ, Jiang H, Xu X, Wang W,Duan T.Noninvasive prenatal testing for autosomal recessive conditions by maternal plasma sequencing in a case of congenital deafness.Genet Med, 2014, DOI: 10.1038/gim.2014.51.

[53]Oellrich A, Hoehndorf R, Gkoutos GV, Rebholz-Schuhmann D.Improving disease gene prioritization by comparing the semantic similarity of phenotypes in mice with those of human diseases.PLoS ONE, 2012, 7(6): e38937.

[54]Accetturo M, Creanza TM, Santoro C, Tria G, Giordano A,Battagliero S, Vaccina A, Scioscia G, Leo P.Finding new genes for non-syndromic hearing loss through an in silico prioritization study.PLoS ONE, 2010, 5(9): e12742.

[55]Keller BJ, McEachin RC.Identifying hypothetical genetic influences on complex disease phenotypes.BMC Bioinform,2009, 10(Suppl.2): S13.

[56]Sadasivam RS, Sundar G, Vaughan LK, Tanik MM, Arnett DK.Genetic region characterization (Gene RECQuest)-software to assist in identification and selection of candidate genes from genomic regions.BMC Res Notes, 2009, 2: 201.

[57]Tranchevent LC, Barriot R, Yu S, Van Vooren S, Van Loo P,Coessens B, De Moor B, Aerts S, Moreau Y.ENDEAVOUR update: a web resource for gene prioritization in multiple species.Nucleic Acids Res, 2008, 36(Web Server issue):W377–W384.

[58]Yilmaz S, Jonveaux P, Bicep C, Pierron L, Smail-Tabbone M, Devignes MD.Gene-disease relationship discovery based on model-driven data integration and database view definition.Bioinformatics, 2009, 25(2): 230–236.