上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2转基因猪胚胎成纤维细胞的构建与鉴定

黄海城，刘 欢，安 靓

（1.南方医科大学肿瘤研究所，广州 510515；2.深圳华大基因研究院，深圳 518083）

上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2转基因猪胚胎成纤维细胞的构建与鉴定

黄海城1，刘 欢2，安 靓1

（1.南方医科大学肿瘤研究所，广州 510515；2.深圳华大基因研究院，深圳 518083）

目的构建上皮组织特异性表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1（N-LMP1）和人补体受体2（CR2）真核表达载体，转染猪胚胎成纤维细胞并筛选整合有N-LMP1和CR2基因的细胞克隆，为构建与EBV感染相关的猪鼻咽癌模型奠定基础。方法通过直接合成ED-L2启动子和N-LMP1，从人B淋巴细胞中的RNA经RT-PCR扩增出CR2，将上述3个片段逐个连接到真核表达载体pN1上，构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的载体pN1-EDL2-N-LMP1-CR2；用脂质体转染猪胚胎成纤维细胞，经药物G418筛选和PCR鉴定阳性克隆。结果成功构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的真核表达载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2，并成功整合到猪胚胎成纤维细胞的基因组中，获得了整合有目的基因N-LMP1和CR2的猪胚胎成纤维细胞克隆。结论获得了上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的猪胚胎成纤维细胞克隆，为通过细胞核移植方法获得表达N-LMP1和CR2转基因猪提供了供体细胞。

N-LMP1；CR2；猪胚胎成纤维细胞；鼻咽癌

鼻咽癌是中国最常见的头颈部肿瘤之一，发病率逐年增长，具有明显的地域性。在其多因素的发展过程中，遗传易感性、EB病毒和环境因素被认为是主要原因。EBV是如何进入鼻咽部上皮细胞从而引发鼻咽癌的，至今仍未定论，但B淋巴细胞膜上的EB病毒受体己经明确为CR2［1-3］，有关上皮细胞是否表达CR2至今仍有争论，但己有多位研究者尝试用不同的方法将CR2基因导入多种细胞，所有研究均证实，在提高细胞内CR2表达水平后，EBV可成功感染原不能感染的细胞，或能明显提高细胞对EBV的感染率［4-7］。LMP1基因是EB病毒最可能的瘤基因，在鼻咽癌组织中获得的LMP1（N-LMP1）基因不仅在DNA序列上与标准实验株B95-8来源的LMP1（B-LMP1）存在明显差异，而且在功能上与后者也不尽一致，特别是N-LMP1的致瘤能力明显强于B-LMP1［8-10］。因此构建EBV感染相关的猪鼻咽癌模型时，用N-LMP1就更具有针对性。选用特异性启动子ED-L2构建组织特异性表达目的基因的转基因动物已成为一种较成熟的手段。Nakagawa，H.［3，11］曾利用ED-L2启动子指导目的瘤基因CyclinD1在转基因鼠舌头、食道、前胃和皮肤组织特异性表达。蓝柯曾用ED-L2启动子调节鼻咽癌来源的LMP1建立转基因小鼠，并观察到LMP1基因在F0代小鼠鼻咽部出现了不典型增生病变［3，12］。从ED-L2的表达特性来看，它具有嗜上皮性，而且在鼻咽上皮的表达活性较高，因此，如果利用ED-L2构建转基因，可望使目标基因在鼻咽上皮高水平表达。

猪在解剖、组织、生理和营养代谢、血液生化指标、疾病发生过程等方面与人类极为相近［13］，猪作为实验动物的一个重要应用是建立人类疾病模型，近年来，体细胞基因修饰技术、体细胞核移植技术的发展使得对猪等大动物进行高效的基因操作成为可能［14，15］。应用该技术只需要对猪的体细胞进行基因修饰，而后通过体细胞核移植即可获得可稳定遗传的基因修饰猪，此项技术的发展推进了猪作为人类疾病动物模型的研究。运用该技术，猪作为人类疾病动物模型已应用在糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病及人类异种器官移植等方面［16-20］，但在有关鼻咽癌方面尚未见报道。本实验构建了整合了N-LMP1和CR2基因的猪胚胎成纤维细胞，为制备鼻咽部高表达N-LMP1和CR2转基因猪提供前提条件，为今后构建与EBV感染相关的猪鼻咽癌模型奠定基础。

1 材料和方法

1.1 质粒、菌种和细胞

E.coli DH5α、质粒pN1、第一个黄种人基因组测序所使用的炎黄细胞［21］（感染EB病毒后永生化的人淋巴细胞）和猪胚胎成纤维细胞均由华大基因研究院动物基因工程实验室提供，质粒pGH-ED-L2和pGH-N-LMP1均由上海捷瑞生物工程有限公司合成

1.2 工具酶与主要试剂

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于New England Biolabs，2*Taq Plus PCR Master Mixture、pMD®18-T Vector、第一链cDNA合成试剂盒均购自TaKaRa（大连）公司，基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均购自TIANGEN（北京）公司，Lipofectamine 2000来自Invitrogen（美国）公司，胎牛血清、高糖DMEM、G418、谷氨酰胺和非必须氨基酸均购自Gibco（美国）公司。

1.3 引物设计与合成

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.4 各元件PCR产物的获得与克隆

1.4.1 ED-L2启动子的获得：以质粒pGH-ED-L2为模板，表1中ED-L2-F和ED-L2-R为引物进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸5min。将所获得的ED-L2片段与pMD18-T Simple载体连接、转化，构建ED-L2的克隆质粒，经PCR鉴定后由华大基因测序。

1.4.2 N-LMP1基因的获得：以质粒pGH-N-LMP1为模板，表1中N-LMP1-F和N-LMP1-R为引物进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸5min。将所获得的N-LMP1片段与pMD18-T Simple载体连接、转化，构建N-LMP1的克隆质粒，经PCR鉴定后由华大基因测序。

1.4.3 CR2基因的获得：培养炎黄细胞后提取细胞总RNA，反转录成第一链cDNA，按照第一链cDNA合成试剂盒说明书操作。以第一链cDNA为模板，表1中CR2-F和CR2-R为引物进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；最后72℃延伸7min。将所获得的CR2片段与pMD18-T Simple载体连接、转化，构建CR2的克隆质粒，经PCR鉴定后由华大基因测序。

1.5 N-LMP1和CR2上皮组织特异表达载体的构建

用SmaⅠ和Age I双酶切CR2基因回收产物，与同样酶切处理的pN1载体进行连接，构建pN1-CR2重组质粒；用Bgl II和Sal I双酶切N-LMP1基因回收产物，与同样酶切处理的pN1-CR2载体进行连接，构建pN1-N-LMP1-CR2重组质粒；用Ase I和Bgl II双酶切ED-L2启动子回收产物，与同样酶切处理的pN1-N-LMP1-CR2载体进行连接，转化E.coli DH5α感受态，卡那青霉素筛选培养，挑取阳性克隆后提取质粒，获得表达载体pN1-ED-L2-NLMP1-CR2，对重组质粒进行酶切和DNA测序鉴定。

1.6 转染

将猪胚胎成纤维细胞接种于12孔板培养皿中，待细胞生长至85％～90％融合度时弃培养基，用PBS洗涤细胞2次。在微量离心管中准备溶液A、B。A液：1μg质粒+50μL无血清培养基；B液：5μL Lipofectamine 2000+50μL无血清培养基。A、B两液室温孵育5min后温和混合，室温放置20min，加入到培养皿内，再用15％胎牛血清-DMEM完全培养基稀释至1mL，将培养皿放入38℃、5％CO2培养箱中孵育培养，整个过程不加双抗。

1.7 阳性克隆的筛选与鉴定

转染72h后，在含有G418（500mg/mL）的选择培养基中加压筛选8d，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，扩增培养。取少量细胞提取基因组DNA进行PCR鉴定，将鉴定阳性的细胞扩大培养冻存，留作核移植供体细胞。

2 结果

2.1ED-L2、N-LMP1和CR2的扩增

图1 ED-L2、N-LMP1和CR2的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of ED-L2，N-LMP1 and CR2

通过PCR扩增，获得794bp的ED-L2序列和1 290bp的N-LMP1序列（图1），获得的DNA片段，大小与预期结果一致，经测序鉴定正确。通过RT-PCR扩增，获得3 115bp的CR2片段（图1），经测序鉴定与GenBank中序列进行Blast比对，结果一致。

图2 重组质粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的构建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2

2.2 上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的表达载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的构建与鉴定

2.2.1 pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的构建：构建的载体以ED-L2为启动子，N1自带的SV40polyA为终止信号，Neomycin是G418筛选标记。见图2。

2.2.2 pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2载体的酶切鉴定结果：重组质粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2经Ase I和Sal I双酶切后理论上可切出7 218bp的片段和2 071bp的片段，经Ase I单酶切为9.3kb的片段，电泳图片符合理论要求，且测序与预期序列完全一致，载体构建成功。见图3。

2.3 阳性克隆的鉴定

在含有G418的选择培养基中筛选8d，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，提取细胞基因组DNA为模板扩增出N-LMP1基因（1 290bp）和CR2基因（3 115bp）片段，说明所得到的阳性细胞的基因组已经插入了目的片段。见图4。

图3 重组质粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2 by enzyme digestion

3 讨论

LMP1基因是EB病毒最可能的瘤基因，在EB病毒与鼻咽癌的关系这一研究领域中，LMP1的研究是一大热点。LMP1是一跨膜蛋白，标准株EBV来源的LMP1（B-LMP1）含有386个氨基酸，它由一个短的N端胞内区，跨膜区及一个长的C端胞内区组成。NPC来源的LMP1基因（N-LMP1）由Hu等克隆，来自中国鼻咽癌患者，它的DNA序列与标准株LMP1存在明显差异，最明显的差异在于它的第三外显子有一个30bp碱基的缺失和3个33bp重复序列的插入，从而导致它编码404个氨基酸［8］。研究表明，N-LMP1在生物学功能上与标准株LMP1至少存在如下不同点［3，9，10，22，24］：1、N-LMP1比BLMP1致瘤性强；2、N-LMP1活化NFkB的能力比BLMP1强；3、N-LMP1的免疫原性比B-LMP1低；4、N-LMP1比B-LMP1能更大程度上调EGFR的表达。CR2是一个分子量为145kD的单链糖蛋白，N端在细胞外，含20个氨基酸的疏水信号肤及1005个氨基酸的膜外区，接着是24个氨基酸的疏水跨膜区，C端由34个氨基酸构成胞浆尾，属单一跨膜蛋白受体。CR2原为补体C3d的配体，后来的研究发现，EBV主要壳膜糖蛋白gp350/220分子中含有与C3d分子受体结合区核心序列EDPGKQLYNVEA高度同源的序列EDPGFENVEI，因而EBV同样可与CR2分子结合［25］。为了能在鼻咽部上皮组织细胞里同时表达N-LMP1和CR2这两种蛋白，本实验运用了上皮特异性启动子ED-L2，构建了载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2，N-LMP1和CR2之间含有环-螺旋结构，导致两个目的基因翻译后不会形成融合蛋白。本研究所构建的载体经酶切与测序鉴定正确，将载体转入猪胚胎成纤维细胞，所获得克隆细胞经PCR鉴定目的基因N-LMP1和CR2，获得整合了两个目的基因的胚胎成纤维细胞，为以后利用核移植技术生产鼻咽部上皮表达N-LMP1和CR2转基因猪提供了供体细胞，为今后构建与EBV感染相关的猪鼻咽癌模型奠定了基础。

图4 阳性克隆的鉴定A：PCR products of the N-LMP1 gene；M：DNA marker（1kp）；Lane 1：Positive control；Lane 2-3：Clone cells；Lane 4：Negative control；B：PCR products of the CR2 gene；M：DNA marker（1kp）；Lane 1：Positive control；Lane 2-3：Clone cells；Lane 4：Negative control.Fig.4 Identification of the positive clone cells

［1］Chodosh J，Gan Y，Holder VP，et al.Patterned entry and egress by Epstein-Barr virus in polarized CR2-positive epithelial cells［J］.Virology，2000，266（2）：387-396.

［2］Nemerow GR，Moore MD，Cooper NR.Structure and function of the B-lymphocyte Epstein-Barr virus/C3d receptor［J］.Adv Cancer Res，1990，54：273-300.

［3］Frade R，Barel M，Ehlin-Henriksson B，et al.gp140，the C3d receptor of human B lymphocytes，is also the Epstein-Barr virus receptor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1985，82（5）：1490-1493.

［4］Volsky DJ，Shapiro IM，Klein G.Transfer of Epstein-Barr virus receptors to receptor-negative cells permits virus penetration and antigen expression［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1980，77（9）：5453-5457.

［5］Li QX，Young LS，Niedobitek G，et al.Epstein-Barr virus infection and replication in a human epithelial cell system［J］.Nature，1992，356（6367）：347-350.

［6］纪志武，李保民，曾毅.采用病毒受体基因转移技术建立EB病毒细胞感染模型［J］.病毒学报，1994，10（2）：154-158.

［7］Fingeroth JD，Diamond ME，Sage DR，et al.CD21-Dependent infection of an epithelial cell line，293，by Epstein-Barr virus［J］.J Virol，1999，73（3）：2115-2125.

［8］Hu LF，Zabarovsky ER，Chen F，et al.Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1 gene（LMP1）from a Chinese nasopharyngeal carcinoma［J］.J Gen Virol，1991，72（Pt 10）：2399-2409.

［9］Hu LF，Chen F，Zheng X，et al.Clonability and tumorigenicity of human epithelial cells expressing the EBV encoded membrane protein LMP1［J］.Oncogene，1993，8（6）：1575-1583.

［10］Li SN，Chang YS，Liu ST.Effect of a 10-amino acid deletion on the oncogenic activity of latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus［J］.Oncogene，1996，12（10）：2129-2135.

［11］Nakagawa H，Wang TC，Zukerberg L，et al.The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue，esophagus and forestomach［J］.Oncogene，1997，14（10）：1185-1190.

［12］蓝轲，乔贵林，沈新民，等.鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1的表达诱发转基因小鼠鼻咽不典型增生［J］.动物医学进展，2002，23（5）：46-48.

［13］王桂花，尹晓敏，孙霞，等.国内外小型猪资源概况［J］.中国比较医学杂志，2009，19（2）：71-73.

［14］Dinnyes A，De Sousa P，King T，et al.Somatic cell nuclear transfer：recent progress and challenges［J］.Cloning Stem Cells，2002，4（1）：81-90.

［15］魏庆信，郑新民，赵浩斌，等.转基因猪研究进展［J］.中国比较医学杂志，2005，15（2）：112-115.

［16］Umeyama K，Watanabe M，Saito H，et al.Dominant-negative mutant hepatocyte nuclear factor 1alpha induces diabetes in transgenic-cloned pigs［J］.Transgenic Res，2009，18（5）：697-706.

［17］Yang D，Yang H，Li W，et al.Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning［J］.Cell Res，2011，21（6）：979-982.

［18］陈华.小型猪动脉粥样硬化模型［J］.中国实验动物学报，2008，16（5）：376-380.

［19］Kragh PM，Nielsen AL，Li J，et al.Hemizygousminipigs produced by random gene insertion and handmade cloning express the Alzheimer's disease-causing dominant mutation APPsw［J］.Transgenic Res，2009，18（4）：545-558.

［20］俞远京.转基因克隆猪与人类异种器官移植［J］.中国比较医学杂志，2004，14（1）：50-53.

［21］Wang J，Wang W，Li R，et al.The diploid genome sequence of an Asian individual［J］.Nature，2008，456（7218）：60-65

［22］Johnson RJ，Stack M，Hazlewood SA，et al.The 30-base-pair deletion in Chinese variants of the Epstein-Barr virus LMP1 gene is not the major effector of functional differences between variant LMP1 genes in human lymphocytes［J］.J Virol，1998，72（5）：4038-4048.

［23］Miller WE，Cheshire JL，Baldwin AJ，et al.The NPC derived C15 LMP1 protein confers enhanced activation of NF-kappa B and induction of the EGFR in epithelial cells［J］.Oncogene，1998，16（14）：1869-1877.

［24］Trivedi P，Hu LF，Chen F，et al.Epstein-Barr virus（EBV）-encoded membrane protein LMP1 from a nasopharyngeal carcinoma is non-immunogenic in a murine model system，in contrast to a B cell-derived homologue［J］.Eur J Cancer，1994，30A（1）：84-88.

［25］Nemerow GR，Houghten RA，Moore MD，et al.Identification of an epitope in the major envelope protein of Epstein-Barr virus that mediates viral binding to the B lymphocyte EBV receptor（CR2）［J］.Cell，1989，56（3）：369-377.

Construction and identification of transgenic porcine embryonic fibroblasts expressing epithelium-specific N-LMP1 and CR2

HUANG Hai-cheng，LIU Huan，AN Jing
（Cancer Institute，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

ObjectiveTo construct an eukaryotic expression vector and identify the integration of nasopharyngeal carcinoma-derived oncogene latent membrane protein 1（N-LMP1）and CR2 gene in porcine embryonic fibroblasts，and to provide a basis for construction of EBV-infection associated swine nasopharyngeal carcinoma model.MethodsED-L2 and N-LMP1 were synthesized directly.CR2 was amplified by RT-PCR from human B lymphocytes.The three fragments mentioned above were subcloned one by one into the eukaryotic expression vector pN1，and then the vector was transfected into porcine embryonic fibroblasts using the liposome reagent，according to the manufacturer's protocol.The cells were selected with G418 antibiotic and identified by PCR amplification.ResultsN-LMP1 and CR2 epithelium-specific expression vector was successfully constructed and integrated into the genome of the porcine fibroblasts，and clone cells integrating the N-LMP1 and the CR2 genes were obtained.ConclusionsThe porcine fibroblast clones integrating N-LMP1 and CR2 are obtained and they should be of great value for the construction of N-LMP1 and CR2 transgenic swine via cellnuclear transfer.

N-LMP1；CR2；Porcine embryonic fibroblasts；Nasopharyngeal carcinoma

R33

A

1671-7856（2014）02-0001-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.001

国家高技术研究发展计划（863计划）（K1010524）。

黄海城（1989-），男，硕士研究生，主要从事肿瘤基础研究，E-mail：haicheng891@qq.com。

安靓（1959-），女，教授，主要从事干细胞与肿瘤干细胞的分化研究及转基因动物的研究，E-mail：anjing77@163.com。

2013-11-19