特异性拟杆菌引物在珠江三角洲的适应性研究

王海鹰,贾乐华,吴仁人,王菊芳,宁正祥

(1.华南理工大学生物科学与工程学院,广东 广州510006；2.环境保护部华南环境科学研究所,广东 广州510640；3.广东省水与大气污染防治重点实验室,广东 广州510640；4.华南理工大学轻工与食品学院,广东 广州510006)

特异性拟杆菌引物在珠江三角洲的适应性研究

王海鹰1,贾乐华1,吴仁人2,3*,王菊芳1,宁正祥4

(1.华南理工大学生物科学与工程学院,广东 广州510006；2.环境保护部华南环境科学研究所,广东 广州510640；3.广东省水与大气污染防治重点实验室,广东 广州510640；4.华南理工大学轻工与食品学院,广东 广州510006)

在珠江三角洲地区采集人、猪、牛、狗以及家禽等33个粪便样品,高效提取基因组DNA,选取14种特异性拟杆菌引物进行检验分析,并进一步采用已知污染源类型的水样对其进行验证.结果表明:采用粪便样品DNA专属提取试剂盒和水体样品DNA专属提取试剂盒提取的基因组模版纯度和提取率均符合后续实验要求.拟杆菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)检出率为85%(28/33),特别是对哺乳类动物和鸡的粪便具有更高的检出率.人的拟杆菌特异性引物3#(HF134F/ Bac708R)和4#(HF183F/Bac708R)、反刍动物的拟杆菌特异性引物8#(CF128F/Bac708R)以及猪的拟杆菌特异性引物10#(PF163F/Bac708R)在珠江三角洲地区同时具有较高的灵敏度和较强的特异性.水体样品验证实验与实际污染类型相符,说明拟杆菌通用引物2#、人的特异性引物3#和4#以及猪的特异性引物10#在珠江三角洲地区具有很好的适用性.

拟杆菌；特异性引物；灵敏度；特异性；珠江三角洲地区

随着我国畜禽养殖的发展及规模的扩大,粪便产生量的不断增加,畜禽养殖业带来的生态环境问题也变得日益突出[1].未经处理(或未完全处理)的粪便随径流进入地表水,造成环境水体中微生物污染较为普遍[2].由于缺乏粪便污染来源的准确信息使得目前治理仍停留在见污治污阶段,极大增加了污染治理的难度与成本.近年来,欧美等发达国家纷纷开展了以宿主特异性生物标记为基础的水体微生物污染源解析的研究工作,并已开发出了猪[3]、牛[4-5]、人[6-8]、鸡[9]、野禽[10-11]等动物的多种特异性引物.

然而,宿主消化道内各种肠道菌群之间的相互作用极为复杂,并且外界环境的差异性易导致消化道内菌群的基因发生变化,造成不同地区特异性基因表达差异的现象较为普遍,如Okabe等[12]针对猪体设计的引物Bac41F/PS183R 在日本的札幌和江别市进行检测时具有很好的特异性,而 Mieszkin等[13]在法国验证的结果表明该引物虽然在猪的粪便样品中可完全得到扩增,但在其他某些动物的粪便样品中也有阳性结果产生.

目前,部分已开发出的宿主特异性引物在当地已有很好的验证,但其特异性在我国尚不明确,因此应积极开展地域适应性的生物标记研究.本研究提取珠江三角洲地区人和多种动物粪便样品的 DNA,选取不同的特异性引物对宿主 DNA进行验证,并进一步采用已知污染来源的水样验证,以探寻其地域适应性,为珠江三角洲地区水域粪便污染来源分析提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器:PCR 仪(ALD1234, ALS1296, Bio-Rad公司),冷冻离心机(5804R,Thermo公司),凝胶成像仪(212PRO,GelLogic公司)

主要试剂:粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司),omega Water DNA Kit (OMEGA Bio-Tek D5525-01),PCR kit(2× Reaction Mix,Taq DNA聚合酶,广州东盛生物科技有限公司),蛋白酶 K(天根生化科技有限公司),DNA marker(Takara),琼脂糖(Biowest,电泳级).

1.2 样本采集

1.2.1 粪便样品 2013年4～5月在广东境内东江和北江流域的多个畜禽养殖场采集家禽、家畜、狗等生物粪便样品,在医院的配合下采集广州地区人的粪便样品.粪便样品数共计33份,其中:广州市萝岗区13份、广州市白云区9份、广州市越秀区5份、广东省清远市1份、广东省惠州市5份;鸡9份、猪8份、牛6份、人5份、鸭2份、狗1份、鹅1份、鸽1份.所有样品编号,保存于冰盒中,在6h内运抵实验室进行后续实验.

1.2.2 水体样品 对已知造成粪便污染的水体进行样品采集.其中广州市污水处理厂A和B进水口水样各1份、以及惠州某生猪养殖场旁水塘水样1份.样品编号,保存于冰盒中,在6h内运抵实验室进行后续实验.

1.3 DNA提取

粪便样本基因组 DNA提取:采用粪便基因组DNA提取试剂盒通过悬浮、破碎、吸附柱纯化等步骤从粪便样品中提取基因组DNA,具体步骤按照说明书进行.

水体样本基因组DNA提取:用0.22μm微孔滤膜过滤水样,将滤膜剪碎置于50mL离心管中,按照omega Water DNA Kit的说明,提取水体中的DNA.DNA 样品于-20℃保存备用.

1.4 PCR扩增

拟杆菌通用引物及人和不同动物拟杆菌引物见表1. PCR反应体系20μL:2×Reaction Mix10μL,Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL,10μmol/L上下游引物各0.8μL,DNA模板(5ng/μL)0.4μL,灭菌超纯水7.6μL; PCR扩增条件:94℃预变性3min,94℃变性30s,53～62℃退火30s(不同引物退火温度具体见表1),72℃延伸90s,重复30个循环,72℃延伸10min; PCR结果检测:以2000bp DNA marker为标准,PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳.

1.5 数据分析

灵敏度(r)和特异性(s)分析采用以下公式计算:r＝[TP/(TP＋FN)] ,s＝[TN/(TN＋FP)][14].其中:TP表示PCR引物对自己种属的样品进行扩增时的阳性样本数(真阳性),FN表示PCR引物对自己种属的样本进行扩增时的阴性样本数(假阴性);TN表示PCR引物对其他种属的样品进行扩增时的阴性样本数(真阴性),FP表示PCR引物对其他种属的样品进行扩增时的阳性样本数(假阳性).

表1 不同宿主的拟杆菌特异性生物标记引物Table1 Host-specific primers of Bacteroidales from selected species

2 结果与讨论

2.1 基因组DNA提取

采用试剂盒抽提的粪便基因组DNA和水样基因组DNA的浓度、提取率以及A260/A280的比值如表2所示.在电泳图中这些条带明亮且单一,可以用于后续PCR实验.本研究使用的专属粪便基因组DNA和水样基因组DNA提取试剂盒中的离心吸附柱能高效、专一吸附DNA,最大限度地去除杂质蛋白及其他有机化合物.将 CTAB法以及试剂盒提取方法得到的基因组DNA进行了对比,发现采用试剂盒抽提方法得到的基因组纯度和提取率均符合后续实验的要求,并且在对大量样本进行抽提时具有效率高,稳定性好等优点.

2.2 粪便样品对特异性生物标记引物的验证

以得到的粪便样品基因组 DNA为模板,选取已有拟杆菌通用引物,人的拟杆菌引物,反刍动物拟杆菌引物以及猪的拟杆菌引物,分别进行PCR扩增,每一对引物扩增得到的阳性样本数统计结果以及灵敏度和特异性分析分别见表3和表4.

采用拟杆菌通用引物(1#、2#)对33个粪便样品(人、猪、牛以及家禽等)和1个作为阴性对照的大肠杆菌样品分别进行PCR扩增,阳性样本分别为15和28个.如表3中统计所示,鸭、鹅、鸽样品在用拟杆菌通用引物、人的拟杆菌引物、猪的拟杆菌引物、反刍动物拟杆菌引物进行 PCR扩增时,均为阴性.这与之前的文献中指出禽类和鸟类与人、猪、牛、羊等哺乳动物粪便中的优势菌群存在差异的报道一致.总体而言,拟杆菌为人、猪、牛、羊等哺乳动物粪便中的优势菌群[21],而禽类和鸟类与之有较大差异.如Lu等[9]在鸡的粪便中提取了471个基因序列,多样性结果显示微生物分属19个不同的菌属,主要有梭状芽孢杆菌(20.9%)、芽孢杆菌(17.3%)和拟杆菌(15.0%),在野鹅粪便中芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌为优势菌属[10].对比可知,2#引物在以拟杆菌为优势菌群的哺乳类动物粪便中具有更高的检出率,对鸡粪便中拟杆菌也有很好的识别.

表2 粪便样品和水体样品基因组DNA浓度,A260/A280值以及提取率Table2 Absorbance ratio of260/280nm, concentration and extraction rate of genome DNA of fecal and water samples

为了考察各类已开发的特异性引物的地区适应性,采集生物粪便样品分别进行验证.采用人的特异性引物(3#～7#)分别对所采集的样品进行PCR扩增,除3#外其它引物对人类粪便均有100%灵敏度.但5#和6#引物除了对人类粪便外,对猪、牛、鸡等动物粪便也具有假阳性响应,而4#和7#引物的特异性较好(分别为96%和93%).当采用反刍动物特异性引物对牛粪便样本进行PCR检测时,8#引物的灵敏度和特异性均为100%.而9#引物分别为67%和41%,不适合于目标研究区域使用.猪的特异性引物(10#～14#)灵敏度都比较高,只有11#引物在所检测的6个样本中阳性结果为83%,其他引物均能全部扩增得到目标产物.在灵敏度相对较高的4对引物中,10#和14#引物的特异性最好,分别为92%和95%,但引物14在进行PCR扩增时得到的目标条带较引物10弱.综合以上结果可知,拟杆菌通用引物2#(Bac32F/ Bac708R)、人的特异性引物3#(HF134F/ Bac708R)和引物4#(HF183F/Bac708R)、反刍动物特异性引物8#(CF128F/Bac708R)以及猪的特异性引物10#(PF163F/Bac708R)同时具有较高的灵敏度和较强的特异性,在目标研究区域具有很好的适应性.同时,由于鹅、鸽、狗等动物不是珠江三角洲地区常见养殖品种,以致只采集到有限数量的样本,本研究所采用的生物标记引物对其特异性有待进一步加强验证.

拟杆菌近年来被广泛应用在水体微生物源解析领域.与大肠杆菌相比,拟杆菌在哺乳动物粪便的数量远远大于大肠杆菌,在水体中有较长的存在时间,同时拟杆菌中的一些特异性的分子标记比大肠杆菌的检测更为灵敏,具有更好的宿主特异性.但由于宿主消化道内各种肠道菌群之间的相互作用极为复杂,并且外界环境的差异性易导致消化道内菌群的基因发生变化,因此特异性引物存在较明显的地区差异性.如对加拿大安大略省和美国俄亥俄州野鹅粪便的生物多样性比对发现,前者芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌两种优势菌分别占46.3%和38.4%,而后者则分别为30.2%和28.9%[10].在特异性基因表达方面,因地区差异造成特异性基因表达不同的现象更为普遍.如 Okabe 等[12]针对猪体设计的引物Bac41F/ PS183R(12#)在日本的札幌和江别市进行检测时具有很好的特异性,而Mieszkin 等[13]在法国布列塔尼地区验证的结果表明该引物虽然在猪的粪便样品中可完全得到扩增,但是在其他物种的一些样品中也有阳性结果产生.本研究中,该引物在部分人类、牛和鸡的粪便中可被扩增,也证明其地域差异性,不适合在珠江三角洲地区使用.此外,Bernhard等[17]设计了人的2种特异性引物 HF134F/ Bac708R(3#)和HF183F /Bac708R(4#),验证发现3#引物与其他的动物之间没有发现交叉反应,且在人的粪便样品中普遍存在,同时具有较好的敏感性和特异性,4#引物只在不到一半的人粪便样品中有特异性扩增.而在珠江三角洲地区的验证发现,3#引物虽然有很好的特异性,但灵敏度仅为80%.但4#引物在目标研究区域中对所检测的5个人粪便样品有全部阳性响应,其它30个非人粪便样品中,仅有一个假阳性响应.可见4#引物适合在珠江三角洲地区推广使用.

2.3 已知污染源水样对特异性生物标记引物的验证

表3 拟杆菌引物PCR阳性结果Table3 Positive results obtained with Bacteroidales biomarkers

表4 拟杆菌引物灵敏度与特异性分析Table4 Sensitivity and specificity of the Bacteroidales biomarkers analyzed

拟杆菌是常寄居哺乳动物体内的一类革兰氏阴性、无芽孢、专性厌氧的细菌[22],其在有氧条件下存活的状态不尽相同,大部分拟杆菌在有氧环境中只能存活几个小时.但仍有拟杆菌的DNA 在水体中存在数天乃至数周仍然可以被检测到,为其在微生物溯源中的应用提供了可能[23].而目前不同拟杆菌生物标记进入环境中的存在时间和迁移转化规律尚不明确.因此,采用上述实验中灵敏度和特异性均较好的引物(拟杆菌通用引物2#、人特异性引物3#和引物4#、反刍动物特异性引物8#、猪特异性引物10#)分别对广州市污水处理厂A和B(生活污水)进水口、以及惠州某生猪养殖场旁水塘等已知污染源类型的水样进行分析检验,结果如图1～图3所示.

图1 A水处理厂进水口水样PCR扩增结果Fig.1 Water genome DNA from water treatment company A amplified with host-specific different Bacteroidales primers

图2 B污水处理厂进水口水样PCR扩增结果Fig.2 Water genome DNA from water treatment company B amplified with host-specific different Bacteroidales primers

图3 惠州农村猪舍旁水塘水样PCR扩增结果Fig.3 Water genome DNA from the pool next to the hoggery of Huizhou amplified with host-specific different Bacteroidales primers

当采用拟杆菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)对上述水样进行PCR扩增时,所有样品均有目标条带的扩增(条带2),推测水样受到粪便污染.采用人的特异性引物3#(HF134F/Bac708R)和4#(HF183F/Bac708R)对水样进行扩增时,两个生活污水处理厂进水口的水样均得到了目标条带(条带3和4),猪舍旁水塘的水样未有目标条带,表明市政污水中有人类粪便的排放,但猪舍旁水塘未受受到人类粪便污染.当上述水样都采用反刍动物特异性引物8#(CF128F/Bac708R)进行PCR扩增时,均未得到目标条带,说明市政污水和猪舍旁水塘的水体并没有受到牛、羊等反刍动物粪便的污染.以上说明实验结果与事情情况完全相符.采用猪的特异性引物10#(PF163F/Bac708R)对水样进行 PCR扩增时,猪舍旁水塘的水 PCR结果为阳性,而生活污水处理厂进水口的水PCR结果也为阳性,只在采用相同的模板量进行扩增时,生活污水处理厂进水口的水扩增条带稍微弱一些,但是因为没有采用定量PCR,所以不能严格区分这两者的差别.实验室自来水采用上述5对引物进行PCR扩增时,结果都为阴性(图4).

目前,拟杆菌常作为特异性生物标记用来检测水体中粪便污染来源.本实验根据已有的拟杆菌通用引物、人、反刍动物以及猪的拟杆菌引物,对珠江三角洲地区采集的粪便样品进行验证,得到多个适合目标研究区域且灵敏度较高和特异性较好的引物,并初步在已知污染来源的水样中得到验证.在本实验中,由于客观条件的限制,分析的粪便样本以及已知污染来源的水样样本数相对较少,需要进一步进行大量样本的验证,为珠江三角洲地区水体环境提供可靠的粪便污染来源分析.此外,由于自然环境和社会发展水平等因素的差异,欧美与我国在微生物源解析研究的关注点上有较大不同.比如美国农场牛的存栏数为8930万头(截至2013年1月1日),每年牛粪产生量约10亿t[24],为畜禽废弃物的最大来源.爱尔兰每年畜禽养粪便产生量约为1亿t,其中牛和羊的产生量占总量的96%[25].而我国畜禽养殖主要以猪和禽类为主,以广东为例,猪和鸡粪便的年产生量约占总量的63%,牛粪只占约17%,与欧美的社会情况相比有着非常明显的差异.欧美等国在对反刍动物和的微生物多样性[26]、源解析[27]和病源微生物[28]等方面有较多研究,但对猪和家禽类的关注相对较少.因此,需针对我国特色加强种类单一、地区适应性不好的特异性引物设计和开发工作.

图4 实验室自来水水样PCR扩增结果Fig.4 Tap water genome DNA of the lab amplified with host-specific different Bacteroidales primers.

3 结论

3.1 拟杆菌为哺乳类动物粪便的优势菌群,因此具有更高的检出率.

3.2 识别出人的特异性引物 4#(HF183F/ Bac708R)、反刍动物特异性引物8#(CF128F/ Bac708R)以及猪的特异性引物10#(PF163F/ Bac708R)在珠江三角洲地区同时具有较高的灵敏度和较强的特异性.

3.3 水体样品验证实验与实际污染类型相符,说明拟杆菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)、人的特 异 性 引 物 3#(HF134F/ Bac708R)、4#(HF183F/Bac708R)和 猪 的 特 异 性 引 物10#(PF163F/Bac708R)在珠江三角洲地区具有很好的适用性.

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Study on sensitivity and specificity of the Bacteroidales biomarkers for microbial source tracking in the Pearl River Delta region.

WANG Hai-ying1, JIA Le-hua1, WU Ren-ren2,3*, WANG Ju-fang1, NING Zheng-xiang4
(1.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou510006, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou510655, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou510655, China；4.School of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou510006, China). China Environmental Science,2014,34(8)：2118～2125

A total of33 fecal samples of human and different animal species were collected in the Pearl River Delta region. Genomic DNA were then efficiently extracted and amplified by using14 specific Bacteroidales primers that have been reported as tracking markers of different sources. Primers with high specificity and sensitivity were then selected and used for polluted water samples analysis. The results show that the purity and extract efficiency of the genome DNA meet the requirement of the following experiments.85% of the33 fecal samples analyzed were positive when using Bacteroidales universal primer2#(Bac32F/Bac708R), and most of the mammalian animals and chicken fecal samples were detected as positive samples when use this primer. Human-specific marker3#(HF134F/Bac708R) and4#(HF183F/Bac708R), ruminant-specific marker8#(CF128F /Bac708R)and porcine-specific marker10#(PF163F/Bac708R)showed high sensitivity and specificity in the Pearl River Delta region. Polluted water samples analysis results were the same as the actual type of pollution, implying Bacteroidales universal primer2#, human-specific primer3#and4#and porcine-specific primer10#could be used as pollution tracking markers in the Pearl River Delta region.

t：Bacteroidales；specific markers；sensitivity；specificity；Pearl River Delta region

X172

：A

：1000-6923(2014)08-2118-08

王海鹰(1983-),女,湖南沅江人,博士,主要从事微生物检测方面研究.

2013-12-02

国家自然科学基金项目(41303054);广东省自然科学基金项目(S2012040007463);中国博士后科学基金面上资助项目(2012M521593);中国博士后科学基金特别资助项目(2013T60796)

* 责任作者, 工程师, wurenren@scies.org