毛细管区带电泳－间接紫外法快速测定食品中的甜蜜素

陈 桐， 丁晓静， 李一正， 赵旭东， 赵 珊

（1.首都医科大学公共卫生学院，北京100069；2.北京市疾病预防控制中心，食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室，北京100013；3.首都医科大学附属北京安贞医院，北京100029；4.首都师范大学化学系，北京100089）

甜蜜素又称环己基氨基磺酸钠，因其口感好且价格低廉而成为我国食品行业中应用最多的甜味剂之一［1］。然而其代谢产物环己胺对心血管系统和睾丸有毒性［2］、对肾功能也有一定的损害等副作用［3］，过量甜蜜素还会对饮用水造成污染［4］。因此，美国、英国、日本和东南亚等禁止其作为食品添加剂使用［5］。我国于1987年批准使用，主要用于蜜饯、酱菜、糕点、炒货等，但有严格的限量要求，如饮料类最大使用量为0.65 g／kg，蜜饯类为1.0 g／kg，话梅、陈皮等为8.0 g／kg［6］。但甜蜜素违规添加的现象时有发生［7］，为保护消费者健康，有必要建立简单、快速的食品中甜蜜素的测定方法。

目前基于分离技术测定甜蜜素的方法有高效液相色谱法（HPLC）［8－10］、高效液相色谱－串联质谱法（HPLC－MS／MS）［7，11－14］、气相色谱法（GC）［15，16］、离子色谱 法 （IC）［17－19］及 毛 细 管 电 泳 （CE）法［3，20－22］等。其中HPLC需消耗大量有机溶剂。HPLCMS／MS对样品前处理要求较高，经常需固相萃取净化后才能进样，无疑增加了检测成本。而国家标准GC法测定前需进行亚硝化衍生，易出现假阳性［1］，而且样品前处理所需时间长，所用试剂毒性也比较大［17］，难以满足大批量样品快速检测的需求。尽管改进的样品前处理方法不断推出，但前处理仍需大量有机溶剂且时间仍较长［23，24］。IC需使用较昂贵的色谱柱，且大部分IC色谱柱不耐有机溶剂，故不能像HPLC色谱柱那样可以用有机溶剂清洗，实际样品分析后易出现柱效下降现象而产生较高的分析成本。CE因较高的分离效率而对样品的前处理要求不高，饮料样品可直接进样测定［3］，固体样品仅需溶解后即可测定［21］，适合于各种食品样品的分析［25］。本研究在文献［22］基础上，采用了全新的分离缓冲体系及检测波长，使方法更耐用、灵敏。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

苯甲酸钠（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；碳酸钠及氢氧化钠（优级纯）购自北京化学试剂公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，≥99%）购自美国Sigma－Aldrich公司；甜蜜素标准品（99%）购自比利时Acros Organics公司；内径75μm未涂敷石英毛细管购自河北永年锐沣色谱配件有限公司；甜蜜素能力验证样品由沈阳产品质量监督检验院提供；其余样品（酸梅汤、苹果醋、果脯（陈皮、蓝莓、无花果、乌梅）及酱菜小萝卜）均购自本地超市。

1.2 仪器与设备

P／ACE MDQ型毛细管电泳仪配二极管阵列检测器（美国Beckman公司）；Millipore Milli－Elix／RiOs型超纯水器（美国 Millipore公司）；F50A型酸度计（北京屹源电子仪器科技公司）；Universal 32高速离心机（德国Hettich公司）；涡旋振荡器（英国Bibby Sterilin有限公司）；A11B S25型均质仪（德国IKA公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准储备液

称取100 mg甜蜜素标准品于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解后稀释，定容至10 mL，配成质量浓度为10 g／L 的甜蜜素标准储备液，转移至10 mL塑料离心管中备用。

1.3.2 样品预处理

液体样品用超纯水稀释后直接进样。固体样品先用均质仪粉碎或用剪刀剪碎，称取0.2 g于10 mL塑料离心管中，加5 mL超纯水，超声提取10 min，9 000 r／min下离心5 min，根据样品中甜蜜素的含量，将上清液直接进样或用超纯水稀释后进样。

1.3.3 毛细管的预处理

新的毛细管用1 mol／L NaOH冲洗20 min，水冲洗5 min及分离缓冲液冲洗5 min。每次进样前用1 mol／L NaOH、水及分离缓冲液洗2 min，以保证方法的重现性。

1.3.4 电泳条件

毛细管：80 cm×75μm （有效长度70 cm）；分离缓冲液：2 mmol／L 苯甲酸钠＋10 mmol／L 碳酸钠＋0.5 mmol／L CTAB；分离电压：－30 kV；检测波长：200 nm；样品室温度：25℃；进样压力及时间：3 448 Pa，18 s；工作电流：约38μA。

2 结果与讨论

2.1 探针和检测波长的选择

甜蜜素没有特征紫外吸收，本实验采用间接紫外法进行测定。通常将有紫外吸收的物质（探针）加到分离缓冲液中，当无紫外吸收的待测物质通过检测器时，分离缓冲液的紫外吸收下降，而产生待测物的倒峰［26］，通过仪器的工作站软件将倒峰转为正峰。一般使用200 nm或205 nm附近的检测波长，以获得绝大多数物质的高灵敏度检出［27］。

间接紫外法中探针的选择原则是［28］：探针的淌度与待分析离子的淌度越匹配越好，否则待分析离子的峰形不好或灵敏度不高。本研究在文献［22］基础上分别考察了苯甲酸钠和山梨酸钾为探针时甜蜜素的检测灵敏度。

苯甲酸钠的最大紫外吸收波长为220 nm，文献［22］选用254 nm作为检测波长，本实验比较了分别在200、220及254 nm检测时甜蜜素的灵敏度，如图1所示。发现200 nm检测的灵敏度最高，故以苯甲酸钠为探针时200 nm为最佳检测波长。

图1 苯甲酸钠为探针时20 mmol／L 甜蜜素在不同检测波长下的电泳图Fig.1 Electropherograms of 20 mmol／L cyclamate at different detection wavelengths using sodium benzoate as probeDetection wavelengths：a.254 nm；b.220 nm；c.200 nm.Capillary：80 cm×75μm（effective length：70 cm）；separation buffer：2 mmol／L sodium benzoate，10 mmol／L sodium carbonate and 0.5 mmol／L hexadecyl trimethyl ammonium bromide；sample extraction solution：pure water；separation voltage：－30 kV；injection pressure and time：3448 Pa×18 s.1.cyclamate.

山梨酸钾的最大紫外吸收波长为251 nm。以山梨酸钾为探针，比较了甜蜜素在200、214及251 nm检测时的灵敏度。发现随着检测波长的增加，灵敏度也越来越高，故以山梨酸钾为探针时251 nm为最佳检测波长。

保持分离缓冲液中其余组分及浓度不变，比较了2 mmol／L 山梨酸钾（检测波长：251 nm）和苯甲酸钠（检测波长：200 nm）作为探针时甜蜜素的峰高及峰形。结果表明：甜蜜素在两种探针体系中的峰高相当，但在山梨酸钾探针体系中的峰形比苯甲酸钠体系中的宽，故本研究选用苯甲酸钠为探针，且检测波长为200 nm。

2.2 探针浓度的选择

探针浓度过低将因电迁移扩散而导致待测物的峰展宽，而探针的浓度过高将影响检测器的线性范围并增加基线噪声，故一般选择探针浓度2～20 mmol／L［29］。保持分离缓冲液中其他组分的浓度不变，苯甲酸钠的浓度从2 mmol／L 至20 mmol／L增大时，甜蜜素的峰迁移时间逐渐增加，且灵敏度越来越低（见图2），故苯甲酸钠的最佳浓度为2 mmol／L。

图2 苯甲酸钠浓度对甜蜜素测定的影响Fig.2 Effects of the concentration of sodium benzoate on determination of cyclamateConcentrations of sodium benzoate：a.2 mmol／L；b.6 mmol／L；c.10 mmol／L；d.20 mmol／L.Other CZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate；other peaks：unknown.

2.3 分离缓冲体系及其浓度的选择

苯甲酸的p Ka＝4.20，氢氧化铵的p Ka＝9.26。文献［22］用10 mmol／L 苯甲酸钠与1 mmol／L 十六烷基三甲基氢氧化铵（pH6.6）作为分离的背景电解质，所用pH6.6既不在苯甲酸钠的缓冲范围（pH3.2～5.2）之内，也不在氢氧化铵的缓冲范围（pH8.26～10.26）之内。不具备缓冲能力的背景电解质使得甜蜜素的迁移时间重现性不好，故作者以α－羟基异丁酸为内标，尽管增加了定量的重现性，但实际操作麻烦。

硼砂因紫外吸收低而成为CE中常用无机缓冲盐。实验初期，向2 mmol／L 苯甲酸钠及0.5 mmol／L CTAB背景电解质中加入10 mmol／L 硼砂。尽管甜蜜素标准溶液的峰形很好，但在实际样品分析中不能实现甜蜜素与基体中杂质峰的分离。用1 mol／L NaOH调节pH后，甜蜜素的峰与杂质峰有分离的趋势，且随着NaOH浓度的增加，分离也越来越好。当 NaOH浓度增至20 mmol／L，且加入1 g／L的高分子添加剂PEG 35000后，甜蜜素与杂质峰达基线分离。此时分离缓冲液pH为10.28，显然超出了硼砂体系的缓冲范围（8.24～10.24）。尽管超出的不多，而且也得到较好的重现性，但为进一步增加分析方法的重现性，用碳酸钠代替硼砂。碳酸的p Ka2＝10.25，碳酸盐的pH缓冲范围为9.25～11.25。无需调节pH，也无需添加高分子添加剂PEG 35000，仅需易于准确配制的3种组分（探针、电渗流反向剂及无机缓冲盐）组成的分离缓冲体系，即可实现实际样品中甜蜜素与杂质峰间的分离。

为避免基体干扰，本研究除检测波长的优化实验中使用标准溶液外，其余条件优化实验均选用苹果醋样品进行优化。间接紫外法需选用低浓度盐作为缓冲溶液，浓度通常控制在5～10 mmol／L 之间［27］。保持其他组分的浓度不变，分别考察了5、10及15 mmol／L碳酸钠对甜蜜素测定的影响。随着碳酸钠浓度的增加，电渗流降低，甜蜜素的迁移时间增加，焦耳热增加而导致甜蜜素的灵敏度下降且峰展宽，故碳酸钠的最佳浓度选为10 mmol／L，如图3所示。

图3 碳酸钠浓度对甜蜜素测定的影响Fig.3 Effect of the concentration of sodium carbonate on the determination of cyclamateConcentrations of sodium carbonate：a.5 mmol／L；b.10 mmol／L；c.15 mmol／L.Other CZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate；other peaks：unknown.

2.4 分离缓冲液中电渗流反向剂的选择

甜蜜素在碱性分离缓冲液中带负电，从而向阳极迁移而不能迁移至阴极的检测窗口，故需加入电渗流反向剂CTAB，以保证带负电的甜蜜素迁移方向与电渗流方向一致并能够迁移到检测窗口而被检测，从而缩短分析时间。0.5 mmol／L CTAB足以保证电渗流反向并获得稳定的电渗流［30］，故本研究选择向分离缓冲液中添加0.5 mmol／L CTAB。

2.5 毛细管内径、长度及进样时间的选择

无论从检测灵敏度还是分离度方面考虑，内径50μm的石英毛细管最为常用，故实验初期选用60.2 cm×50μm（有效长度：50 cm）的毛细管，进样时间为10s，甜蜜素的检出限为55.6 mg／kg。为进一步增加检测灵敏度，改用75μm内径的毛细管，但为了避免因内径增加而导致的分离柱效下降，增加管长至80 cm（有效长度：70 cm）。这样做的好处是在尽量不降低柱效的同时还可以增加进样量，从而进一步增加检测灵敏度，而灵敏度的增加意味着将实际样品稀释更多的倍数后仍能够检测到其中的甜蜜素，同时还可通过多倍数稀释消除基体干扰，避免基体对毛细管的污染，这也是本研究能够分析食品中甜蜜素的关键所在。

优化进样时间（10、15、18、20及25 s），结果表明随着进样时间的增加，灵敏度越来越高，然而峰也越来越宽，故本研究选用进样时间为18 s。

2.6 分离电压的选择

升高电压可缩短分析时间，但过高的电压可使电流增加，产生过量的焦耳热。这些热量不能及时散失，使径向温度梯度加大，导致区带展宽，反而会使分离效率和灵敏度下降。但本实验采用的无机盐缓冲液浓度不高，仅为10 mmol／L Na2CO3，电压从20、25及28 kV增加至30 kV时仍未观察到峰展宽。考虑到分离时间，选择－30 kV为分离电压。

2.7 样品前处理条件的选择

甜蜜素的水溶性好，可通过简单的用水稀释的方式将样品电导值降至低于分离缓冲液的电导值，以利于样品堆积而进一步增加检测灵敏度，基体干扰被消除的同时仍能够检测到其中的甜蜜素。与目前的国家标准GC方法［15］相比，极大地减少了样品前处理时间，提高了样品分析的通量。

2.8 工作曲线、线性范围、检出限和精密度

将甜蜜素的储备液用水逐级稀释成1.2、2.5、5、10、20、40及80 mg／L 标准工作液，在上述优化的电泳条件下依次进样分析，校正峰面积外标法定量。校正峰面积（A）与质量浓度（x，mg／L）间呈良好线性关系，线性回归方程A＝286.55x＋45.799，相关系数r＝0.999 9，线性范围1.2～80 mg／L，检出限8.9 mg／kg（S／N＝3），定量限26.7 mg／kg（S／N＝9）。

将2.5、10及20 mg／L 甜蜜素标准溶液分别连续进样7次，以考察仪器精密度。得到迁移时间的RSD分别为0.1%、0.1%及0.07%；校正峰面积的RSD分别为6.4%、3.9%及2.0%。按1.3.2节中的方法平行处理7份样品后进样测定，以考察方法的日内精密度，测定结果的RSD为2.6%。每天平行测定两份样品，连续测定7天，以考察方法的日间精密度，测定结果的RSD为4.5%。

2.9 回收率试验

以市售不含甜蜜素的样品为空白样品，按1.3.2节前处理方法，分别在2.5、10及20 mg／L这3个水平进行加标回收试验，电泳图见图4。每个加标水平平行处理5份样品进行测定，结果见表1。

图4 空白样品加标的电泳图Fig.4 Electropherograms of spiked blank samplesa.blank sample；b.blank sample spiked with 10 mg／L cyclamate；c.10 mg／L cyclamate standard.CZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate.

表1 方法的加标回收率结果（n＝5）Table 1 Results of the recovery test（n＝5）

2.10 样品分析

利用所建立的方法测定了甜蜜素能力验证样品，结果为0.094 g／kg（以环己基氨基磺酸计），Z比分值＝－0.8，与国家标准 GC 法［15］所测结果（0.098 g／kg）相吻合，进一步证实了本方法的准确性。在此基础上对7件食品样品进行了分析，结果见表2，未发现超标样品。其中无花果果脯样品的电泳图见图5。

表2 食品中甜蜜素的测定结果（n＝5）Table 2 Contents of cyclamate in food samples（n＝5）

图5 无花果果脯样品的电泳图Fig.5 Electropherogram of fig fruit sampleCZE conditions are the same as in Fig.1.1.cyclamate.

3 结论

采用毛细管区带电泳－间接紫外法，利用简单的无机盐分离缓冲体系，11 min（预清洗6 min；分离5 min）内即可完成甜蜜素的分离与测定。样品前处理简单，无需衍生，仅需用水提取，极大地降低了检测成本，提高了实际样品的分析速度，并获得可与国家标准方法相媲美的准确定量结果。然而与国家标准方法形成鲜明对比的是，整个分析过程无需有机溶剂，适合于大量常规样品的高通量分析。

［1］ Han H，Ji Y B，Li J L，et al.Journal of Green Science and Technology（韩华，纪元兵，李洁莉，等.绿色科技），2013（3）：148

［2］ Zeng S D，Du H Q，Guo H B，et al.Journal of Food Safety and Quality（曾绍东，杜海群，郭宏斌，等.食品安全质量检测学报），2013，4（1）：239

［3］ Jiang Y X，Wei R X，Yang G Z，et al.Journal of Instrumental Analysis（蒋奕修，魏瑞霞，杨桂珍，等.分析测试学报），2009，28（7）：838

［4］ Yang S C，Liu H F，Wang J，et al.Journal of Food Industry（杨双春，刘慧芳，王健，等.食品工业），2013，34（4）：181

［5］ Zhao Y.Food and Nutrition in China（赵耀.中国食物与营养），2004（8）：31

［6］ GB2760－2011

［7］ Wang Q，Ding Y C.Chemical Analysis and Meterage（王群，丁轶聪.化学分析计量），2012，21（4）：62

［8］ Zhao Z L，Xie F，Jia K J，et al.Food Science and Technology（赵志磊，谢飞，贾克军，等.食品科技），2013，38（2）：301

［9］ Liu F，Wang Y，Wang Y H，et al.Chinese Journal of Chromatography（刘芳，王彦，王玉红，等.色谱），2012，30（3）：292

［10］ Scotter M J，Castle L，Roberts D P T，et al.Food Addit Cont－am，2009，26（5）：614

［11］ Cheng T Y，Liu B，Li Z B，et al.Journal of Food Industry（程铁辕，刘彬，李哲斌，等.食品工业），2012，33（11）：147

［12］ Ji C，Feng F，Chen Z X，et al.Chinese Journal of Chromatography（嵇超，冯峰，陈正行，等.色谱），2010，28（8）：749

［13］ Xia Y L，Li M C，Zhang Y，et al.China Brewing（夏于林，李明春，张莹，等.中国酿造），2011（3）：156

［14］ Huang Z Q，Ma J Y，Chen B，et al.Anal Chim Acta，2006，555：233

［15］ GB／T5009.97－2003

［16］ Hashemi M，Habibi A，Jahanshahi N.Food Chem，2011，124：1258

［17］ Wang A Y，Zhai Z L，Lu S G.Modern Preventive Medicine（王爱月，翟志雷，卢素格.现代预防医学），2013，40（11）：2106

［18］ Zhu Y，Guo Y Y，Ye M L，et al.J Chromatogr A，2005，1085（1）：143

［19］ Chen Q C，Mou S F，Liu K N，et al.J Chromatogr A，1997，771：135

［20］ Gao W H，Pei H，Yang G J.Journal of Food Science and Biotechnology（高文惠，裴红，杨桂君.食品与生物技术学报），2010，29（3）：326

［21］ Bergamo A B，da Silva J A F，de Jesus D P.Food Chem，2011，124：1714

［22］ Thompson C O，Trenerry V C，Kemmery B.J Chromatogr A，1995，704：203

［23］ Chen G L，Chen K，Zhang D F，et al.Zhejiang Preventive Medicine（陈国亮，陈坤，张大帆，等.浙江预防医学），2008，20（11）：96

［24］ Song R X，Xie X Y.Food Research and Development（宋瑞霞，谢翔燕.食品研究与开发），2008，29（1）：128

［25］ Yoshikawa K，Saito S，Sakuragawa A.Food Chem，2011，127：1385

［26］ Johns C，Macka M，Haddad P R.Electrophoresis，2003，24：2150

［27］ Chen Y.Capillary Electrophoresis Technology and Application：2nd ed.Beijing：Chemical Industry Press（陈义.毛细管电泳技术及应用：2版.北京：化学工业出版社），2006

［28］ Macka M，Johns C，Doble P，et al.LCGC，2001，19（1）：38

［29］ Xu X，Kok W T，Poppe H.J Chromatogr A，1997，786：333

［30］ Xie N，Ding X J，Wang X Y，et al.J Pharm Biomed Anal，2014，88：509