黑木耳的富硒发酵

刘建荣，顾雅君，张瑞英

（1.河北大学 生物技术研究中心；2.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002）

黑木耳 （Auricularia auricula）是一种食药兼用的大型真菌，具有润肺补脑、补血养容、止痛止血等多种功效。自20世纪60年代发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来［1］，人们广泛开展了对黑木耳多糖的研究，并已证实其具有抗氧化、降血脂、抗辐射、抗凝血及抑制肿瘤等生物活性［2，3］。硒（Se）是人与动物体正常生理活动所必需的一种微量元素，人体的贫血、冠心病、大骨节病、糖尿病、癌症等多种疾病都与人体内缺乏硒元素相关［4］。然而硒在自然界中的含量相当稀少和分散，且常以无机盐态存在，不利于人体吸收。黑木耳菌丝体具有很强的富硒能力［5］，能将无机硒转化为有机的硒多糖和硒蛋白，而黑木耳硒多糖对肿瘤生长的抑制作用优于黑木耳多糖［6］。因此，富硒食用菌制品的开发成为研究热点。本研究对黑木耳冀诱1号的最适液体发酵培养基增补亚硒酸钠进行富硒发酵，以期获得富硒1菌丝体，改善黑木耳品质，从而为开发富硒黑木耳食药制品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种和仪器

黑木耳冀诱1号品种（由河北省科学院微生物研究所提供）；UV－1800紫外可见分光光度计（天美有限公司）。

1.2 培养基

1.2.1 PDA斜面培养基（g／L）

去皮马铃薯200g，切碎，加水1000ml，煮沸30min，纱布过滤后加琼脂20g，加热溶解后加葡萄糖20g，分装试管，121℃湿热灭菌20min后取出，摆斜面，冷却后贮存备用。

1.2.2 液体发酵培养基（g／L）

培养基A：蔗糖30g，麸皮煮汁50g，酵母膏5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，自然pH。

培养基B：去皮马铃薯200g，硫酸镁1g，VB 110mg，葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，自然pH。培养基C：葡萄糖20g，豆饼粉5g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾2g，自然pH。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

用接种铲将斜面保存菌种分割为黄豆粒大小的小菌块，转移到新鲜的PDA斜面培养基上，26℃下恒温培养，待菌丝长满斜面试管后使用。

1.3.2 最适液体发酵培养基和培养时间的确定

选择3种不同碳氮源的培养基A、B和C，分别配制1000ml，分装于5个500ml三角瓶中，使培养基装液量为200ml。将已活化的PDA斜面菌种切割成黄豆粒大小的小菌块，接种3块于200ml液体培养基中，每组做5个平行试验。于26℃200r／min振荡培养，分别在3，4，5，6，7和8d测定每组发酵液的平均多糖含量和生物量，以确定菌丝体生长最适液体培养基。

1.3.3 黑木耳的富硒液体发酵

选择菌丝生长最适的液体培养基配制1000ml，于5个500ml三角瓶中各分装200ml。准确称取2，6，10，14和18mg亚硒酸钠依次置于5个三角瓶中，使亚硒酸钠浓度依次为10，30，50，70和90mg／L液体培养基。灭菌后接种3块切割为黄豆粒大小的PDA活化菌种，200r／min于上述1.3.2确定的最佳条件进行富硒液体发酵。发酵结束后，分别取样测定不同硒浓度下的发酵液多糖含量和菌丝体生物量、含硒量。

1.3.4 多糖的测定

发酵液多糖测定方法依照文献［7］进行。

1.3.5 生物量的测定

于摇床发酵的不同时间无菌取出20ml发酵液，用150目铜筛网过滤，菌球以蒸馏水多次洗涤后，置于培养皿中于105℃烘干至恒重，分析天平称重各组菌球。

1.3.6 硒含量的测定

黑木耳富硒发酵液中菌丝体硒含量测定依照文献［7］进行。

2 结果和讨论

2.1 最适液体发酵培养基和培养时间的确定

通过对黑木耳发酵液多糖含量和菌丝体生物量的测定，以确定黑木耳液体发酵最适培养基和培养时间，结果见图1和图2。

图1 不同培养基对黑木耳发酵液多糖含量的影响

图2 不同培养基对黑木耳发酵液菌丝体生物量的影响

由图1和图2可知，在3组液体培养基中，随着培养时间的延长，发酵液多糖含量和菌丝体生物量均呈上升趋势，6d达到最高值，之后逐渐下降；多糖含量和菌丝体生物量均以培养基C为最高，在6d时多糖含量和菌丝体生物量分别为20.3g／L和9.37g／L。因此，以液体培养基C培养6d为黑木耳液体发酵的最适条件。结果表明，氮碳源为豆饼粉和葡萄糖的条件下较其他碳氮源黑木耳更容易生长。培养6d后多糖含量和生物量达到最大值，超过6d，黑木耳的生长即进入衰退期。

2.2 黑木耳的富硒液体发酵

2.2.1 不同硒浓度对发酵液菌丝体生物量和硒含量的影响

于优选培养基中添加不同硒浓度进行黑木耳的富硒液体发酵，对发酵液中菌丝体生物量和硒含量的测定结果如表1所示。硒浓度低于50mg／L时，菌丝体的生物量和含硒量均随硒浓度的增高而增加；当硒浓度为50mg／L时，菌丝体的生物量和硒含量均最高，分别为9.37g／L和10.48μg／g，生物量是不加硒时生物量的1.2倍；高于50mg／L时，生物量和硒含量均不增高反而降低。结果表明，黑木耳菌丝体具有富硒能力，但硒浓度过高不利于黑木耳菌丝体的生长和对硒的吸收利用。

表1 不同硒浓度对发酵液菌丝体生物量和硒含量的影响

2.2.2 不同硒浓度对发酵液多糖含量的影响

优选培养基中添加不同硒浓度发酵后对黑木耳发酵液的多糖含量测定结果见表2。由表2可知，亚硒酸钠在10－50mg／L范围时，发酵液多糖含量随硒浓度的升高而增加，且高于不添加硒时的多糖含量，在50mg／L时达到最大值，为20.3g／L，是不加硒时多糖含量的1.3倍，而后多糖含量随硒浓度的增加而降低，且低于未添加硒时液体培养基C在6d时所测得的多糖含量。结果表明，液体培养基中添加适量亚硒酸钠有助于提高发酵液的多糖含量。

表2 不同硒浓度对发酵液多糖含量的影响

3 结论

黑木耳在不同液体培养基发酵过程中，通过对不同培养时间的发酵液多糖含量和菌丝体生物量的测定确定了黑木耳最佳液体培养基配方为葡萄糖20g／L，豆饼粉5g／L，硫酸镁0.5g／L，磷酸二氢钾2g／L，并于26℃培养6d。

以优化培养基对黑木耳进行富硒发酵，黑木耳的确具有较强富硒能力。但培养基中亚硒酸钠的浓度会影响黑木耳的富硒效果及其生长和多糖含量。与不添加亚硒酸钠相比，添加适量亚硒酸钠有利于黑木耳菌丝体对硒的最大吸收和利用，并且可促进黑木耳的生长和多糖含量的提高。然而过量添加，不仅会降低菌丝体对硒的吸收利用，造成浪费，而且抑制黑木耳的生长和降低多糖含量。

黑木耳的富硒发酵研究，丰富了有机硒的来源，为开发天然有机硒多糖提供依据。

［1］ Chihaha G，Maeda Y，Hamuo J，et al.Inhibition of mouse Sarcoma 180by polysaccharides from Lentinus edobes（Berk.）sing［J］.Nature，1969，222（5194）：687－688.

［2］ Fan Y Q，Wu Q H，Sheng J H.Study on the antithrombotic effect of polysaccharide of Auricularia auriculajudae［J］.Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2009，30（6）：410－412.

［3］ 王献友，陈培云，吴广臣，等.黑木耳多糖提取及其药理活性的研究进展［J］.南方农业学报，2012，43（5）：683－687.

［4］ Rayman，M.The importance of selenium to human health［J］.Lancet，2000，356（9225）：233－241.

［5］ 黄春燕，张柏松，万鲁长，等.食用菌富硒培养研究进展［J］.山东农业科学，2012，44（7）：81－87.

［6］ 朱黎霞，周竹音，潘丽媛.黑木耳硒多糖抗肿瘤作用的研究［J］.中国中医药科技，2011，18（5）：454.［7］ 辛树权，王晓光，赵骥民，等.硒元素对黑木耳深层发酵的影响［J］.食品科学，2009，30（7）：202－205.