神经营养因子3壳聚糖支架诱导成年大鼠脑损伤后海马神经网络的形成①

孙敏，张皑峰，杨朝阳，李晓光

神经营养因子3壳聚糖支架诱导成年大鼠脑损伤后海马神经网络的形成①

孙敏1，张皑峰2，杨朝阳1，李晓光1

目的观察神经营养因子3(NT-3)壳聚糖支架诱导神经突触形成，修复成年大鼠创伤性脑损伤。方法60只成年雄性Wistar大鼠平均分为单纯损伤组、单纯壳聚糖支架组和NT-3壳聚糖支架组，分别于术后3 d、7 d、14 d、28 d和60 d，通过免疫组织化学方法检测损伤区神经再生。术后30 d和60 d应用神经示踪方法与免疫电镜技术观察损伤区内再生的神经突触。结果NT-3壳聚糖支架组海马损伤区内nestin+、微管蛋白β-tubulin-Ⅲ+、微管相关蛋白2(MAP2)+神经细胞较单纯壳聚糖支架组和单纯损伤组明显增加(P＜0.01)。NT-3壳聚糖支架组在海马损伤区内观察到5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)+/MAP2+双阳性新生神经元，并形成突触联系。结论NT-3壳聚糖支架可激活脑损伤区神经前体细胞增殖，分化为成熟神经元并形成神经突触，参与脑神经网络的重建。

创伤性脑损伤；神经营养因子3壳聚糖支架；神经前体细胞；增殖；分化；突触；神经网络

[本文著录格式] 孙敏，张皑峰，杨朝阳，等.神经营养因子3壳聚糖支架诱导成年大鼠脑损伤后海马神经网络的形成[J].中国康复理论与实践,2014,20(5):428-433.

创伤性脑损伤是由于交通事故、生产事故及意外导致的常见外源性脑疾病[1]。创伤性脑损伤后导致神经元死亡或丢失，造成多种神经功能缺陷，其中海马损伤导致认知功能缺陷，严重影响患者的空间学习与记忆功能。研究表明，在成年哺乳动物脑内特殊区域(脑室下区和海马齿状回)存在持续的神经发生，可产生新的神经元[2]。神经环路重建是指新生神经元之间能够建立突触联系，整合入宿主组织，形成有功能的神经回路[3]。成体神经发生包括从分裂开始，到成熟、整合、有功能的新神经元出现及存活的全部神经元发育过程[4]。成年哺乳动物体内神经前体细胞多数处于静止状态，当脑损伤使细胞微环境发生变化，静止的神经前体细胞可以被激活、增殖，但大多数分化成星形胶质细胞参与瘢痕的形成，几乎不能或极少能分化为神经元[5]。本课题组前期研究表明，神经营养因子3(neurotrophin-3,NT-3)壳聚糖支架具有良好的组织相容性，有利于新生组织的形成及减少炎症等不良反应[6]。本实验观察应用NT-3壳聚糖支架移植修复脑损伤后，损伤区内神经前体细胞能否增殖分化为成熟神经元，新生的神经元形成突触联系并整合入宿主组织重建神经环路。

1 材料和方法

1.1 材料

60只成年雌性Wistar大鼠，体重200 g，SPF级，首都医科大学实验动物部提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 大鼠6%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射麻醉。腹面向下固定于大鼠立体定位仪上；头部正中矢状切口，切开皮肤及皮下组织，钝性分离，暴露颅骨。根据大鼠脑立体定位图谱确定损伤区域为前囟后(-)3.7～3.9 mm，正中线左旁开(L)1～3 mm，硬脑膜下(V)3 mm，门齿棒低于耳间线(-)3.3 mm。手术显微镜下，牙科钻掀去骨瓣，注意不要损伤硬脑膜[6]；打开硬脑膜，采用本实验室自制的“生物组织吸除装置”[7]机械性损伤并吸除体积约为2×2×3 mm脑组织，包括海马CA1区及覆盖其上的大脑皮质。

单纯损伤组(n=20)不施加任何干预措施；单纯壳聚糖支架组(n=20)在损伤区移植不载有NT-3的壳聚糖支架；NT-3壳聚糖支架组(n=20)损伤区内移植载有NT-3的壳聚糖支架。支架大小与吸除脑组织相仿。缝合皮肤切口，碘酒消毒伤口。置温暖环境待其苏醒后送返饲养室，予糖盐水和食物。术后腹腔注射青霉素105U/d，共7 d。

1.2.2 5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记 术后第2天予BrdU (SIGMA公司)5 mg/100 g腹腔注射，每12小时注射1次，共7 d。

1.2.3 免疫组织化学染色 分别于术后3 d、7 d、14 d、28 d、60 d每组各任取3只大鼠，4%多聚甲醛心脏灌注固定后取脑，置于4℃4%多聚甲醛溶液6 h，取出放于30%PB蔗糖溶液脱水2周，冰冻切片机大脑冠状面连续冰冻切片，切片厚14 μm。

1.2.3.1 神经丝蛋白(NF) 1∶50鼠抗NF(中杉金桥) 4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗鼠IgG二抗，室温12 h，加入1∶300辣根过氧化物酶标记链酶卵白素三抗，室温过夜。3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色，苏木素复染核，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.3.2 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)1∶80兔抗GFAP (中杉金桥)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗兔IgG二抗，室温12 h，加入1∶300辣根过氧化物酶标记链酶卵白素三抗，室温过夜。DAB显色，苏木素复染核，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.3.3 巢蛋白(nestin) 1∶100鼠抗nestin(SIGMA公司)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗鼠IgG二抗，室温12 h，加入1∶300辣根过氧化物酶标记链酶卵白素三抗，室温过夜。DAB显色，苏木素复染核，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.3.4 微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ) 1∶50兔抗β-tubulin-Ⅲ(MILLIPORE公司)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗兔IgG二抗，室温12 h，加入1∶300辣根过氧化物酶标记链酶卵白素三抗，室温过夜。DAB显色，苏木素复染核，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.3.5 微管相关蛋白2(MAP2) 1∶80兔抗MAP2 (MILLIPORE公司)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗兔IgG二抗，室温12 h，加入1∶300辣根过氧化物酶标记链酶卵白素三抗，室温过夜。DAB显色，苏木素复染核，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.4 生物素化葡聚糖胺(BDA)神经示踪 术后60 d，脑损伤区对侧(右侧)CA3区注射BDA(中杉金桥)。注射点(2点)位于前囟后(-)3.3 mm、正中线右旁开(R)3 mm、硬脑膜下(V)3.9 mm，以及前囟后(-)3.6 mm、正中线右旁开(R)3 mm、硬脑膜下(V)3.7 mm。每只动物每点以0.1 μl/min的速度，注射0.4 μl。注射后24 h灌杀取脑，冰冻切片机大脑冠状面连续冰冻切片，切片厚20 μm。

1.2.4.1 MAP2免疫荧光染色 1∶80兔抗MAP2一抗4℃孵育60 h，加入1∶100 Texas-red标记的山羊抗兔IgG荧光二抗，室温避光10 h，加入1∶2000 Hoechst 33342，室温孵育5 min。50%甘油PB封片，荧光显微镜下观察。

1.2.4.2 GFAP免疫荧光染色 1∶80兔抗GFAP一抗4℃孵育60 h，加入1∶100 Texas-red标记的山羊抗兔IgG荧光二抗，室温避光10 h，加入1∶2000 Hoechst 33342，室温孵育5 min。50%甘油PB封片，荧光显微镜下观察。

1.2.5 免疫电镜取材与染色 术后30 d和60 d，各组任取大鼠3只，0.075%戊二醛+4%多聚甲醛冰上灌流取材，置0.075%戊二醛+4%多聚甲醛3 h，振动切片，厚40 μm。切片漂洗后入3%H2O2孵育10 min，漂洗，2 mol/L盐酸室温孵育30 min，四硼酸钠孵育10min；漂洗，1%羊血清室温封闭1 h，加入1∶100小鼠抗BrdU(中杉金桥)、1∶200兔抗大鼠MAP2，室温孵育过夜，漂洗，加入1∶50纳米金颗粒二抗(NANOPROBES公司)，室温孵育2 h，银增强试剂盒(NANOPROBES公司)室温孵育10 min，ABC试剂盒(中杉金桥)孵育过夜。DAB呈色，锇酸固定、脱水、树脂包埋，高温聚合，电镜超薄切片，置镍网上用Philips CM120电镜观察。

1.3 统计学分析

每个动物从前囟中心-3.7 mm到-3.9 mm行20张冠状脑切片。计数高倍视野下海马区各种标记物阳性细胞数，共4个视野。计量数据均采用(±s)表示，采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色

术后60 d，NT-3壳聚糖支架组损伤区内观察到大量NF+细胞及神经纤维(图1a)；单纯壳聚糖支架组可见少量NF+细胞呈网格状分布(图1b)，单纯损伤组损伤区内未见NF+细胞(图1c)，仅损伤边缘可见少量NF+细胞。细胞计数显示，NT-3壳聚糖支架组(167.17±9.989)，单纯壳聚糖支架组(83.00±10.018)，单纯损伤组(15.92±3.343)，有非常高度显著性差异(F= 978.416,P=0.000)。

损伤区与正常组织交界处GFAP+细胞数，NT-3壳聚糖支架组(19±6.937)，显著少于单纯损伤组(70± 15.912)(F=73.136,P=0.000,图2a、图2b)。

术后3 d，各组损伤边缘均可见nestin+细胞。损伤后7 d，NT-3壳聚糖支架组损伤区内有大量nestin+细胞，损伤区内残留一些未降解的载体(图3)。术后7 d，NT-3壳聚糖支架组nestin+细胞数(83.83±6.686)，单纯壳聚糖支架组(34.5±4.908)，单纯损伤组(7.92± 1.832)，有非常高度显著性差异(F=740.502,P=0.000)。

术后14 d，NT-3壳聚糖支架组损伤区出现大量β-tubulin-Ⅲ+细胞(图4)。术后28 d，NT-3壳聚糖支架组β-tubulin-Ⅲ+细胞数从(47.08±3.232)减少到(26.75± 3.817)(F=198.333,P=0.000)；单纯壳聚糖支架组从(26.83±3.243)减少到(14.45±2.207)(F=112.34,P= 0.000)；单纯损伤组从(10.08±2.906)减少到(7.92± 2.065)(F=4.431,P=0.47)。

术后28 d，NT-3壳聚糖支架组观察到损伤区内出现大量MAP2+细胞(图5)，这种增殖趋势持续到术后60 d。MAP2+细胞数从(89.58±4.033)增加到(152.42± 7.141)(F=704.401,P=0.000)。

2.2 免疫电镜

术后30 d，NT-3壳聚糖支架组损伤区观察到BrdU+/MAP2+神经元(图6a)；术后60 d，损伤区内可见新生神经元形成的多突触联系(图6b)。单纯损伤组损伤区未观察到神经元。

2.3 BDA神经示踪

术后60 d，NT-3壳聚糖支架组荧光显微镜下观察到损伤对侧BDA+细胞通过海马CA3锥体细胞的轴突，沿着海马联合，穿过GFAP+胶质瘢痕(图7a)进入损伤侧海马CA1区，在损伤区内观察到BDA+神经细胞(图7b)，部分BDA+细胞同时表达MAP2(图7c)。

图1 术后60 d各组NF+细胞(免疫组织化学染色)

图2 术后60d NT-3壳聚糖支架组和单纯损伤组GFAP+细胞(免疫组织化学染色)

图3 NT-3壳聚糖支架组nestin+细胞(术后7 d,免疫组织化学染色)

图4 NT-3壳聚糖支架组β-tubulin-Ⅲ+细胞(术后14 d,免疫组织化学染色)

图5 NT-3壳聚糖支架组MAP2+细胞(术后28 d,免疫组织化学染色)

图6 NT-3壳聚糖支架组BrdU+/MAP2+神经元(免疫电镜)

图7 NT-3壳聚糖支架组BDA示踪(免疫荧光染色)

3 讨论

传统观点认为，成年哺乳动物体内不存在神经发生，中枢神经一旦死亡，不能够再生，神经细胞丢失是永久性的，只能由胶质细胞替代[8]。因此，中枢神经损伤后的治疗与恢复非常困难。近年的研究表明，成体脑能够不断产生新生神经元，可以在解剖上整合到宿主脑内，定位于脑的病变部位，表达适当的神经递质和受体，并形成精确的轴突投射[9]。脑损伤后2周可在CA3区观察到新生神经元产生的轴突及树突，4周能形成成熟突触结构，参与神经通路重建修复[9]。这些新生神经元可通过整合到神经系统的微回路内，替代丢失的神经元，从而发挥功能。前期研究表明，移植NT-3壳聚糖材料组可以明显改善创伤性脑损伤所致认知功能缺陷[6]。

3.1 NT-3壳聚糖支架促进神经再生

NT-3主要分布于中枢神经系统内，在海马、小脑、大脑皮质、三叉神经中脑核神经元和结状神经节等神经元中表达，以海马和小脑含量较高[8]。将载有NT-3的成纤维细胞移植到脊髓损伤处，损伤后第10周所有移植物中都有轴突生长，表明NT-3可促进移植物中轴突髓鞘形成[10]。

壳聚糖是一种修复周围神经的导管材料，体外研究发现，在壳聚糖纤维膜上培养与培养基培养的海马神经元，生存分化能力无明显差别，说明壳聚糖生物材料不影响神经元的增殖分化，具有良好的组织相容性、安全性、微生物降解性[11]。本研究结果提示，损伤本身促进损伤区域内神经前体细胞增殖分化能力有限，单纯壳聚糖支架与NT-3壳聚糖支架均能促进神经前体细胞增殖分化为成熟神经元，但NT-3壳聚糖支架组神经再生较单纯壳聚糖支架组明显提高。可能与NT-3促进神经前体细胞的分化、诱导轴突生长有关[12]。将神经营养因子NT-3与壳聚糖结合，使NT-3缓慢释放，可以长期(14周)发挥[13]神经营养因子NT-3激活内源性神经干/祖细胞，促进其增殖、分化为神经元的作用。而单纯壳聚糖支架仅能作为细胞迁移和突起生长的支架。这与以前的研究一致[14]。

3.2 再生神经元形成突触参与宿主脑神经环路的重建

神经元之间突触联系的建立，是神经元网络形成的基础。海马的突触回路中，CA3锥体细胞轴突的Schaffer侧支投射到同侧CA1腔隙层，终止于锥体细胞顶树突干；通过海马联合，CA3锥体细胞的轴突投射到对侧海马的CA1锥体细胞的基树突[8]。

免疫电镜技术是免疫组织化学与电镜技术相结合的产物，可以在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位。利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。研究表明，电镜下成熟突触结构包含以下3个条件：①存在明确的突触后致密物；②100 nm的突触前膜上至少存在4个突触囊泡；③存在清晰的突触间隙[15]。本研究借助纳米金颗粒标记成熟树突MAP2[16]，利用ABC试剂盒及DAB呈色BrdU[9]双标定位。BrdU标记增殖细胞[1]与成熟神经元的标记物MAP2双标说明损伤区内观察到的神经元是新生的成熟神经元。移植NT-3壳聚糖支架术后30 d，损伤区内观察到BrdU+/MAP2+的新生神经元；术后60 d，损伤区内可见新生神经元的同一树突与不同突触前成分形成多突触联系。单纯损伤组损伤区内无法观察到神经元。表明移植NT-3壳聚糖支架后，损伤区内有大量新生神经元，新生神经元形成成熟的突触联系。

BDA是将葡聚糖胺结合到异硫氰酸荧光素制成的一种大分子神经示踪剂，BDA阳性细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光[17]。Veenman等首先将BDA用于顺行性标记神经元的胞体，观察不同区域神经元之间的联系[18]。本研究显示，术后60 d，将神经示踪剂BDA注射到NT-3壳聚糖支架组损伤对侧海马CA3区，在损伤侧海马CA1区内观察到BDA+神经细胞，说明NT-3壳聚糖支架能修复破坏的神经通路。损伤区内部分BDA+细胞同时表达成熟神经元标记物MAP2，提示神经突触参与宿主脑神经通路的重建。

未来有可能通过控制内源性神经前体细胞特异性活化，并沿着所需的神经元或神经胶质细胞谱系分化，诱导患病脑和脊髓的细胞再生修复。哺乳动物脑的正常神经发生区域之外，不存在大量多能前体细胞，如何诱导分布于整个神经轴的少量前体细胞增殖分化，修复损伤区域，是我们当今工作的重点。然而，现在仅仅开始了解神经前体细胞在它们所处的局部微环境中的潜能和信号之间的复杂相互作用；有关内源性干/祖细胞的来源、迁移途径、新生神经元的功能及神经元分化和存活的特异性调节，仍需进一步研究。

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Neurotrophin-3 Chitosan Scaffolds Induced Hippocampal Neural Network Formation after Traumatic Brain Injury in Adult Rats

SUN Min,ZHANG Ai-feng,YANG Zhao-yang,et al.Department of Neurobiology,Capital Medical University,Beijing 100069,China

ObjectiveTo repair the traumatic brain injury in adult rats by inducing neural synapses formation with neurotrophin-3 (NT-3)chitosan scaffolds.Methods60 adult male Wistar rats were equally divided into lesion group,blank chitosan scaffolds group and NT-3 chitosan scaffolds group.The neural regeneration in the lesion area were observed through immunochemistry 3 days,7 days,14 days, 28 days,60 days after operation.Regenerated neural synapses involved the neural circuitry reconstruction in the lesion area were observed through neural tracing and immune electron microscopy 30 days and 60 days after operation.ResultsThe nestin+,β-tubulin-Ⅲ+,microtubule associated protein 2(MAP2)+neural cells in hippocampal lesion area were significantly more in the NT-3 chitosan scaffolds group than in the other groups(P＜0.01).Newborn neurons that express 5-bromouracil deoxyriboside(BrdU)and MAP2 were observed and formed synaptic connections in hippocampal damage zone in the NT-3 chitosan scaffolds group.Regenerated neural synapses involved the neural circuitry reconstruction in the lesion area.ConclusionNT-3 chitosan scaffolds activate the neural progenitor cells to proliferate and differentiate to mature neurons,which form neural synapses to involve the neural circuitry reconstruction.

traumatic brain injury;neurotrophin-3 chitosan scaffolds;neural progenitor cells;proliferation;differentiation;synapses; neural network

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.05.010

R742

A

1006-9771(2014)05-0428-06

2014-03-02

2014-04-11)

1.“十二五”国家科技支撑计划项目(No.2012BAI17B04)；2.国家“863”计划项目(No.2012AA020506)；3.北京市科委重点项目(No. D09080104660000)。

1.首都医科大学神经生物学系，北京市100069；2.首都医科大学附属北京友谊医院口腔科，北京市100050。作者简介：孙敏(1983-)，女，内蒙古包头市人，硕士研究生，主要研究方向：应用组织工程学方法修复脑损伤的研究。通讯作者：李晓光(1959-)，男，汉族，吉林长春市人，博士，教授，主要研究方向：应用组织工程学方法修复神经系统损伤的研究。