云南汉族人群Tim－1基因多态性与系统性红斑狼疮关联性研究

彭传梅，高 辉，付晓野，曹向红，董玉琳，王 杨

云南汉族人群Tim－1基因多态性与系统性红斑狼疮关联性研究

彭传梅，高 辉＊，付晓野，曹向红，董玉琳，王 杨

（昆明医科大学附属延安医院医学检验科，云南昆明650051）

目的探讨Tim－1启动子区－416G＞C和－1454G＞A位点基因多态性与云南高原地区汉族人群系统性红斑狼疮（SLE）的遗传易感性有无关联。方法采用PCR－RFLP方法对132名云南汉族SLE病人和120名健康体检者Tim－1启动子区多态性位点－416G＞C和－1454G＞A的基因多态性进行检测，同时采用间接免疫荧光法检测其抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体三种自身抗体。结果SLE组和对照组Tim－1启动子区多态性位点－416G＞C的基因型及等位基因频率差异均无统计学意义（P＞0.05），而－1454G＞A位点的基因型及等位基因频率在SLE组与对照组中的差异均有统计学意义（P＜0.05）；SLE组和对照组三种SLE相关自身抗体检测阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）；SLE组两个位点不同基因型中三种自身抗体检测阳性率的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论云南汉族人群Tim－1启动子区－416G＞C和－1454G＞A位点存在单核苷酸多态性变异，且－1454G＞A位点多态性变异与SLE遗传易感性相关，但两位点不同基因型不会影响SLE相关自身抗体的表达。

系统性红斑狼疮、T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白－1、基因多态性、遗传易感性

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1961）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种发病缓慢，临床表现多样、涉及机体许多系统和脏器的自身免疫性疾病，其发病率在种族、地区上差别很大：有色人种比白种人发病率高，我国患病率远远高于西方国家。SLE的病因和发病机制尚未完全清楚，一般认为：遗传、环境等为其发病主要诱因。T细胞在SLE的发病过程中扮演重要角色，在其发病的不同环节均存在Th1／Th2细胞的不平衡性［1］。

T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim）基因家族是McIntire等于2001年通过定位克隆技术发现的一个新的基因家族。小鼠Tim家族基因共有8个成员（Tim1－8），人Tim家族基因与小鼠有高度的同源性，在人类Tim家族发现只有3个基因分别为Tim－1，Tim－3和Tim－4，无Tim－2，定位于染色体5q33.2区域［2］。Tim－1基因是Tim基因家族第一个被发现的成员，许多研究［3］表明Tim－1是重要的免疫调节分子，在自身免疫病、过敏性疾病等Th1／Th2相关性疾病中发挥重要作用，但在SLE中的作用研究尚处于起步阶段。

近年来，国内外的研究显示人类Tim－1的启动子区和编码区均存在多态性的变化，这些多态性变化可能与哮喘、过敏性鼻炎和类风湿关节炎等疾病的易感性相关［4－6］。Tim家族基因是否参与SLE的发生发展目前少有报道。云南地处高原、紫外线辐射较强，为SLE高发地区，我们对云南高原地区汉族人群Tim－1启动子区多态性位点－416G＞C和－1454G＞A的多态性与SLE以及与SLE相关自身抗体的关联进行研究，为探索SLE易感的遗传因素提供数据支持，为揭示SLE发病机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1研究对象SLE患者132例，其中男性16例，女性116例，年龄在18－78岁之间。SLE患者符合2009年美国风湿病协会修订的SLE分类诊断标准。对照组为120名云南地区健康体检者，其中男性27例，女性93例，年龄在22－67岁之间，无自身免疫性疾病相关病史。所有对象均为三代以内居住在云南本地汉族居民，所有对象均无血缘关系。

1.2 在知情同意的原则下，采集SLE患者及健康体检者EDTA抗凝静脉血2ml。

1.3自身抗体检测SLE组及对照组均采用荧光免疫印迹试剂盒（Omon，Germany）检测三种自身抗体：抗双链DNA抗体（dsDNA）、抗Sm抗体、抗RNP抗体。

1.4模板DNA提取采用人全血基因组DNA提取试剂盒（Axygen，USA）提取SLE患者及健康体检者外周血基因组DNA，方法严格按照试剂盒的说明书进行，提取产物溶于TE缓冲液，－20℃保存。

1.5多态性位点的选择及引物设计根据文献选择Tim－1的两个多态性位点：－416G＞C和－1454G＞A，每个多态性位点的详细资料见表1。参照GenBank中Tim－1DNA序列（编号AC026777）利用Primer Premier 5.0软件自行设计并核实针对每个位点的PCR扩增引物，引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列及PCR条件见表1。

表1 Tim－1启动子区多态性位点的引物设计

1.6PCR反应PCR反应体系总体积25μl：包括基因组DNA100ng，10×PCR缓冲液2.5μl，2.0 mmol／LMg2＋、dNTPs各10nmol，引物P1和P2各15pmol，TaqDNA聚合酶1U（Omega，USA），不足体积用灭菌双蒸水补充至25μl。PCR反应循环参数：94℃预变性5min，94℃40s，58－65℃40s，72℃60s，35个循环，最后72℃延伸10min。

1.7酶切、琼脂糖电泳PCR产物用内切酶（－416G＞C用TaqⅠ，－1454G＞A用MspⅠ）（Omega，USA）酶切：PCR产物5μl，10×酶切缓冲液1μl，限制性内切酶2U，灭菌双蒸水3.9μl，混匀，TaqⅠ酶切条件为65℃酶切2h；MspⅠ酶切条件为37℃酶切5h。酶切产物用2%琼脂糖电泳、EB染色，观察条带。根据电泳图确定基因型。

1.8测序选取部分代表不同基因型的扩增产物送上海生物工程有限公司测序，验证电泳结果。

1.9统计学分析应用SPSS17.0软件进行统计分析，采用直接计数法计算基因型和等位基因频率，进行Hardy－Weinberg平衡检验（P＞0.05），基因型和等位基因的组间比较、各自身抗体和基因型的相关性比较均采用χ2检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1Tim－1启动子区－416G＞C位点多态性采用PCR－RFCP分析PCR扩增产物879bp。酶切产物获得3种基因型：①纯合子GG基因型：有488bp、391bp 2个片段；②杂合子GC基因型：可见879bp、488bp和391bp 3个片段；③纯合子CC基因型：只有879bp 1个片段。（图1）

2.2基因型测序分析图Tim－1启动子区－416G＞C位点CC、GC、GG基因型测序分析图。（图2）。

2.3Tim－1启动子区－1454G＞A位点多态性采用PCR－RFCP分析PCR扩增产物为515bp。酶切产物获得3种基因型：①纯合子GG基因型：有399 bp、116bp 2个片段；②杂合子GA基因型：可见515 bp、399bp和116bp 3个片段；③纯合子AA基因型：只有515bp 1个片段。（图3）

图1 －416G＞C位点PCR及酶切产物电泳图

图2 －416G／C位点CC、GC、GG基因型测序分析图

图3 －1454G＞A位点PCR及酶切产物电泳图

2.4基因型测序分析图Tim－1启动子区－1454G＞A位点GG、GA、AA基因型测序分析图。（图4）

2.5基因型与等位基因频率分布根据酶切电泳结果，采用直接计数法统计基因型，计算等位基因频率。－416G＞C位点和－1454G＞A位点基因型频数分布符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律（P＞0.05），达到遗传平衡，具有群体代表性（表2）。χ2检验结果显示：SLE组与健康对照组－416G＞C位点基因型和等位基因频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05）；而－1454G＞A位点基因型和等位基因频率分布差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

图4 －1454G＞A位点GG、GA、AA基因型测序分析图

表2 Tim－1基因两位点基因型频数分布的Hardy－Weinberg平衡检验

表3 Tim－1基因两位点基因型频率及等位基因频率

2.6三种SLE相关自身抗体（抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体）检测结果SLE组三种自身抗体检测阳性率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。SLE组各基因型三种自身抗体检测结果：见表4。经χ2检验，SLE组中抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体检测阳性率与Tim－1基因启动子－416G＞C位点和－1454G＞A位点基因分型均无相关性（P＞0.05）。

表4 SLE组两位点各基因型中三种自身抗体检测结果

3 讨论

人类基因组单核苷酸多态性（SNPs）是基因组变异中最常见的一种形式，在人类基因组中大概每1000个碱基就有1个SNP。不同人群之所以对疾病的易感程度有所区别、同种疾病的临床表型不同以及对药物会产生不同反应，部分受到SNP的影响。SNP作为第3代遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析、同种疾病临床表型分析以及药物基因组学的研究中发挥着愈来愈重要的作用。这种多态性在不同种族群体具有差异性。许多研究［7］均表明Tim基因多态性与多种自身免疫性疾病和过敏性疾病的易感性、临床表型有着密切的关系，且不同种族、不同地区之间由于遗传特征不同导致多态性变异亦不同［8－10］，但Tim基因的多态性与SLE的关联研究尚处于起步阶段。

本研究通过PCR－RFLP技术对云南高原地区汉族人群中132名SLE患者和120名健康者的Tim－1启动子区多态性位点－416G＞C和－1454G＞A的多态性进行分析。SLE组与对照组－416G＞C和－1454G＞A位点的基因型分布均符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律检验，达到遗传平衡，具有群体代表性。－416G＞C位点两组间基因型及等位基因频率比较，差异均无统计学意义，－1454G＞A位点两组间基因型及等位基因频率比较，差异有统计学意义，表明云南汉族人群Tim－1启动子区多态性位点－1454G＞A的多态性与SLE的遗传易感性相关。对SLE高度相关三种自身抗体（抗双链DNA抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体）进行分析，SLE组三种自身抗体检测阳性率均高于对照组，差异有统计学意义。另外，SLE组中三种自身抗体阳性率与Tim－1基因启动子区－416G＞C和－1454G＞A位点基因分型均无明显相关性，说明Tim－1基因－416G＞C和－1454G＞A位点不同基因型不会影响SLE相关自身抗体的表达。

［1］周广宇，杨永净.系统性红斑狼疮中T细胞作用的研究进展［J］.国外医学·免疫学分册，2005，28（5）：274.

［2］McIntire JJ，Umet su SE，Akbari O，et al.Identification of Tapr（an airway hyperreactivity regulatory locus）and the linked Tim gene family［J］.Nat Immunol，2001，2：1109.

［3］Kuchroo VK，Umet su DT，DeKruyff RH，et al.The TIM gene family：emerging roles in immunity and disease［J］.Nat Rev Immunol，2003，3：454.

［4］Wu Q，Hu L，Cai P，et al.Association Analysis of TIM－1－232G＞A and 5383＿5397Insertion／Deletion Polymorphisms With Childhood Asthma and Total Serum Immunoglobulin E Levels in Middle China［J］.J Investig Allergol Clin Immunol，2009，19（2）：146.

［5］Mou Z，Shi J，Tan Y，Xu R，Zhao Z，Xu G and Li H.Association Between TIM－1Gene Polymorphisms and Allergic Rhinitis in a Han Chinese Population［J］.J Investig Allergol Clin Immunol，2010，20（1）：3.

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［7］黄 娜，鹿 玲，袁丽萍，等.T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白－1－1454位点基因多态性与儿童过敏性紫癜的关系研究［J］.中国实用儿科杂志，2010，25（2）：139.

［8］Chae SC，Song J H，Lee YC，et al.The association of the exon 4 variations of Tim－1gene with allergic diseases in a Korean population［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（2）：346.

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［10］崔天盆，金 晶，刘昌玉，等.湖北地区汉族儿童Tim－1基因多态性与变应性哮喘关系的研究［J］.中华医学遗传学杂志，2004，21（4）：403.

Association Analysis of Tim－1 Polymorphism With Systemic Lupus Erythematosus in a Han Population of Yunnan Province

PEN Chuan－mei，GAO Hui，FU Xiao－ye，et al.（Department of Medical Laboratory，The Affiliated Yanan Hospital of Kunming Medical University，Yunnan Kunming650051，China）

ObjectiveThe aim of the present study was to analyze the association between the polymorphic sites－416G＞C and－1454G＞A of Tim－1gene and susceptibility to systemic lupus erythematosus（SLE）in a group of Han population from Yunnan province.MethodsPolymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism analysis（PCR－RFLP）was used to detect the polymorphisms of－416G＞C and－1454G＞A sites in 132SLE patients and 120 controls，and we used indirect immunofluorescence assay to detect three related aotuantibodies of SLE，which includethe anti－double stranded DNA（dsDNA）antibody，the anti－Sm antibody and the anti－RNP antibody.ResultsWe found no statistical differences in genotype and allele frequency of－416G＞C between SLE and control group（P＞0.05），but there are statistically significant differences in genotype and allele frequency of－1454G＞A between SLE and control group（P＜0.05）；The positive rate of three autoantibodies between SLE and control group has statistically significant difference（P＜0.05），but the positive rate of three autoantibodies between different genotypes of－416G＞C and－1454G＞A in SLE group had no significant differences（P＞0.05）.ConclusionThe－416G＞C and－1454G＞A sites of Tim－1gene have SNP variations，and the polymorphic variation of－1454G＞A site is related to the susceptibility to SLE in a Han population of Yunnan province，but different genotypes of these two sites don，taffect the expression of related autoantibodies of SLE.

SLE；Tim－1；gene polymorphism；susceptibility

彭传梅，女，34岁，硕士研究生，主治医师，研究方向为自身免疫性疾病发病机理。

2014－05－08）

1007－4287（2014）12－1961－05

云南省科技厅－昆明医科大学联合专项项目（2011FB232）

＊通讯作者

：R593.24

：A