东菱迪芙与依达拉奉联合应用对大鼠脑缺血损伤的研究

金美善，朱恩波，胡 媛，赵 野，李香美，姜美子

东菱迪芙与依达拉奉联合应用对大鼠脑缺血损伤的研究

金美善，朱恩波，胡 媛，赵 野，李香美，姜美子＊

（延边大学附属医院神经内科，吉林延吉133000）

目的探讨东菱迪芙与依达拉奉联合应用对大鼠脑缺血损伤的影响。方法成年健康雄性Wistar大鼠100只，采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）脑缺血再灌注模型，随机分为5组，即假手术组（正常组）、缺血再灌注组、东菱迪芙治疗组、依达拉奉治疗组、联合用药治疗组。运用组织化学染色技术，检测脑梗死体积；运用循环酶法，检测Hcy水平；运用免疫比浊法，检测hs－CRP浓度变化。结果①脑缺血再灌注24h后大鼠脑梗死体积显示，东菱迪芙组、依达拉奉组、联合用药组与缺血再灌注组比较，脑梗死体积均缩小，每组间均有显著性差异（P＜0.05）；联合用药组与东菱迪芙组、依达拉奉组间比较有统计学差异（P＜0.05）。②Hcy检测结果显示，缺血再灌注组显著高于正常组（P＜0.05）；东菱迪芙组显著低于缺血再灌注组（P＜0.05）；依达拉奉组显著低于缺血再灌注组（P＜0.05）；东菱迪芙组显著低于依达拉奉组（P＜0.05）；联合用药组显著低于单药组（P＜0.05）。③超敏C－反应蛋白的测定结果显示，缺血再灌注组显著高于正常组（P＜0.05）；依达拉奉组显著低于缺血再灌注组（P＜0.05）；东菱迪芙组显著低于缺血再灌注组（P＜0.05）；东菱迪芙组显著低于依达拉奉组（P＜0.05）；联合用药组显著低于单药组（P＜0.05）。结论①东菱迪芙与依达拉奉通过缩小急性期脑梗死的梗死体积，降低Hcy和超敏C－反应蛋白水平，可有效减轻脑缺血损伤，均具有脑保护作用。②东菱迪芙与依达拉奉联合应用较单用东菱迪芙治疗或依达拉奉治疗其治疗效果更为显著。

东菱迪芙；依达拉奉；脑梗死体积；同型半胱氨酸；CRP

脑血管病是神经系统最常见的疾病之一，其高瘫痪率、高病死率的特点严重影响患者的生活质量，甚至威胁患者的生命，到目前为止急性期脑梗死治疗关键是：早期干预、预后措施以及提高康复率及降低死亡率，应找到新的靶点并应寻找有效的治疗药物。本实验通过检测Hcy、hs－CRP水平的变化及脑梗死体积的变化，探讨用东菱迪芙和依达拉奉对急性期脑梗死的脑保护作用及其可能机制；探讨联合应用东菱迪芙与依达拉奉对急性脑缺血损伤的治疗效果。

1 材料与方法

1.1材料

健康Wistar大鼠100只，体重200±50g，购自延边大学实验动物中心，东菱迪芙注射液购自北京托毕西药业有限公司，依达拉奉注射液购自吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司，2%氯化苯四氮唑（TTC）磷酸盐缓冲液购自北京化学试剂公司，hs－CRP试剂盒购自德国罗氏诊断有限公司，Hcy试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司。本实验相关的显微镜、低温冰箱、离心机、显微外科手术器械、尼龙线等实验设备均有延边大学附属医院中心实验室提供。

1.2方法

1.2.1 大鼠脑缺血模型的制作

①麻醉：首先固定大鼠，在腹腔注射10%水合氯醛（4ml／1kg），麻醉起效后可进行下一步操作。

②建立大鼠脑缺血再灌注模型：用改良线栓法［1，2］制作大鼠大脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。

首先用碘伏消毒术区，颈部正中线切口，用剪刀左右剥离颌下腺，在左侧的胸骨舌骨肌、肩胛骨舌骨肌之间分离、暴露左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）及其分支颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），避开ECA和ICA交接处迷走神经、气管及交感神经。颈总动脉分叉处底部用手术线结扎，为了达到剥离出颈外动脉主干为目的，枕动脉和甲状腺上动脉从颈外动脉又分出来，此处再次用手术线结扎后套出颈内动脉。解剖显微镜下用纤维剪刀在左侧颈外动脉与颈内动脉交接处邻近颈总动脉处剪小洞，将尼龙线栓（尼龙线一端涂上一层硅树脂，使其成为加粗，直径0.25－0.30mm［1］）线沿小洞口插入至颈内动脉约18mm左右［3，4］，当感觉到阻塞感时返回约1mm，此时线前端已通过大脑中动脉（middle cerebral artery occlusion reperfusion，MCA）根部，阻塞了左侧MCA血流，最后用手术线结扎颈内动脉，切断暴露显示的操作线，各项组织恢复原位后，缝合皮肤。

建立大鼠缺血再灌注模型半小时后，大鼠腹腔内注射各组药物按照上述操作方法各组大鼠腹腔内注射。

1.2.2 大鼠脑缺血后梗死体积测定 ①脑缺血再灌注24h后，按照上述方法麻醉后将大鼠断头取脑。②剥离出脑组织，切片按照冠状形态，每次间隔2mm持续切断。③将脑组织片放入2%氯化苯四氮唑（TTC）缓冲液中，维持37℃之间，避光染色半小时。④正常组织染成粉红色，梗死部位染成白色。⑤测定梗死体积：数码相机拍照保存后，采用LUZEX－F图像分析软件测定梗死体积。

1.2.3 猝死大鼠、测定Hcy及hs－CRP 脑缺血24 h后，按照上述方式给予麻醉，麻醉生效后暴露心脏，用5ml注射器取心室血5ml左右，用循环酶法［5］，采用PPI全自动生化分析仪［6］进行Hcy检测，采用免疫比浊法［7］，用全自动生化仪［8］测定超敏C－反应蛋白指标。

1.2.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，组间采用t检验比较，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1梗死体积测定

测定脑缺血再灌注24h后的大鼠脑梗死体积（表1）提示：脑梗死体积在缺血再灌注组显著大于假手术组、东菱迪芙治疗组、依达拉奉治疗组以及联合用药治疗组（P＜0.05），表明东菱迪芙与依达拉奉两种药物均有效缩小梗死体积作用。联合应用两者用药治疗组与缺血再灌注组比较也有显著的差异（P＜0.05）；东菱迪芙治疗组和依达拉奉治疗组梗死体积比较也有差异。此结果表明，应用东菱迪芙治疗效果优于应用依达拉奉治疗组；联合用药效果更佳。

表1 Wista大鼠的脑梗死体积测定（mm3）（x—±s）

2.2Wista大鼠的血浆Hcy与血清hs－CRP的测定

大鼠局灶性脑缺血24h后，进行Hcy测定结果（表2）显示：脑缺血灌注模型组Hcy明显高于假手术组；脑缺血灌注模型组的同型半胱氨酸水平高于依达拉奉治疗组；依达拉奉治疗组Hcy水平高于东菱迪芙治疗组与联合用药治疗组；联合用药治疗组Hcy水平低于东菱迪芙组。表明东菱迪芙与依达拉奉两种药物均可以针对Hcy有降低效果，单用东菱迪芙的效果优于依达拉奉，联合用药效果更佳，各组之间有显著性差异，P＜0.05，可以认定Hcy对大鼠急性脑缺血损伤是一个敏感标记物。

大鼠脑梗死模型24h后，检测CRP结果（表2）显示：脑缺血再灌注组超敏C－反应蛋白明显高于假手术组；脑缺血再灌注组超敏C－反应蛋白明显高于依达拉奉治疗组；依达拉奉治疗组超敏C－反应蛋白水平高于东菱迪芙治疗组与联合用药治疗组；东菱迪芙治疗组超敏C－反应蛋白水平高于联合用药组，各组间有显著性差异，P＜0.05。根据上述数据，东菱迪芙与依达拉奉两种药物均可能对超敏C－反应蛋白降低效果；单用东菱迪芙的效果优于依达拉奉；联合用药有明显效果。因此CRP可作为大鼠急性脑梗死的一个敏感指标。

表2 Wista大鼠的Hcy与CRP测定（x—±s）

3 讨论

东菱迪芙，原名为东菱克栓酶，是经过生物工程提纯的丝氨酸蛋白酶单成分制剂，是新型强力溶血栓、改善微循环的制剂。近年来，应用东菱迪芙治疗脑梗死已成为安全有效的治疗方法。起病后6小时内的治疗称为超早期治疗，但临床上有相当一部分患者因为各种原因不能在有效的时间窗内得到有效的溶栓治疗。目前临床上，常用尿激酶、重组纤溶酶原激活剂（rt－PA）行溶栓治疗，但因容易出现颅内出血等严重不良反应及治疗时间窗限制了其广泛应用。东菱迪芙治疗时间窗较尿激酶等溶栓药物的治疗时间窗宽，在急性缺血性脑卒中发病2日内治疗仍可取得满意效果，而且东菱迪芙不良反应较少，具有良好的安全性。因此，已成为目前临床应用最多的降纤药物。其可能药理机制为［9，10］：①选择性作用于纤维蛋白原的Aα链末端的精氨酸和甘氨酸之间，使纤维蛋白原分解为纤维蛋白单体，使单体聚合成多聚体，多聚体再分解成纤维蛋白降解产物（FDP），后者被网状内皮细胞吞噬清除，从而在不引起血管内凝血的前提下降低血浆纤维蛋白原，抑制血栓形成和发展；②能促进内皮细胞释放血浆中组织纤溶酶原激活剂（t－PA），促进纤维蛋白酶生成，减少纤溶酶抑制物，全面改善纤溶系统功能，达到溶解血栓的作用；③可降低血粘度，抑制红细胞聚集及增强红细胞变形能力和血管通透性，使血流加速防止血栓形成；④降低血管阻力，增加脑血流量和氧的利用，改善缺血区的血供，缩小半暗带，挽救濒临死亡的脑细胞；⑤清除自由基及使抗脂质过氧化，降低缺血再灌注后组织中一氧化氮的含量，从而降低神经毒性作用，起到脑保护作用。

本实验针对急性脑缺血损伤的大脑进行梗死体积测定结果显示，经东菱迪芙治疗组的脑梗死体积明显小于缺血再灌注模型组，且检测CPR、Hcy水平明显低于缺血再灌注模型组，表明东菱迪芙可有效缩小梗死体积，可通过降低CRP、Hcy水平对急性期缺血性脑卒中具有脑保护作用。

依达拉奉（edaravone）是一种目前为止新发现的、强效的抗氧化剂，具有较强的抗氧化作用，对缺血再灌注诱导的血管内皮细胞损伤，并伴随神经功能缺损起抑制作用。以往的实验研究证明［11－13］，其具有以下作用：①自由基清除作用：对脑缺血周边部位和缺血再灌注部位的DPPH（1，1－二苯基－2－间硝基本偕腙肼）及－OH有明显的清除作用，从而发挥其对脑缺血损伤的保护作用；②抗缺血作用：在大鼠脑缺血－再灌注模型中，大鼠脑缺血－再灌注10min后立即静脉给予4mg／kg的依达拉奉，可阻止缺血诱导的海马CAI区神经元丢失，有抑制缺血区迟发性神经细死亡死的作用；③抑制缺血—再灌注所致脑水肿及脑内白三烯的合成，抑制脑细胞由花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代谢及由15－羟过氧化二十碳四烯酸（15－HPETE）引起的脑细胞过氧化损伤作用，从而达到对脑细胞的保护作用。依达拉奉在脑脊液中的浓度与血浆浓度的比率保持在50%－60%，具有良好的脂溶性.故可以较容易地达到作用部位而发挥其抗脑缺血作用。另外，依达拉奉在治疗过程中，几乎不影响血液流动力学、体温、呼吸、电解质平衡或血糖水平、自主运动、胃肠运动等。

东菱迪芙在脑梗死治疗中的作用已得到广泛认同，依达拉奉在初步的临床应用中显示了良好效果。本实验研究结果发现缺血再灌注组与联合用药组、依达拉奉治疗组、东菱迪芙治疗组相比，脑梗死体积显著缩小，CRP与Hcy水平也明显降低，差异具有统计学意义。显然两种药物联合应用比单用东菱迪芙或依达拉奉更优势依达拉奉与东菱迪芙的作用机制完全不同，可能在治疗中疗有协同作用，依达拉奉与东菱迪芙不会对彼此药理作用产生影响，具有积极的临床意义。

复杂的脑缺血再灌注后损伤机制对目前人类带来巨大的经济负担以及危险。大量研究表明，溶栓及介入治疗仍给患者及家属带来副作用及负担，上述治疗的不断发展及完善已经改善了很多患者生活质量。安全、稳定是降纤治疗临床应用的特点，可间接起溶栓作用，但其针对明确应用于急性脑梗死的早期的溶栓及机制今后有待于进一步探讨。故溶栓及降纤治疗都是有效的治疗急性期脑梗死的关键治疗措施。上述治疗中致残率、死亡率仍很高的原因在于对溶栓及降纤治疗对脑组织缺血后带来的再灌注损伤，尚未发现更为的有效的治疗方案。未来对脑缺血治疗的研究中的关键及核心，从不同发病过程中干预措施，但不可否认观察该病的病理过程，达到治疗脑卒中患者的早期干预、预后措施提高康复率及降低死亡率，找到新的治疗靶点并开发更为有效的治疗药物。

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The effect of Batroxobin combined with Edaravone on the Cerebral Ischemia Injury in Rats

JIN Mei－shan，ZHU En－bo，HU Yuan，et al.（Affiliated Hospital of Yanbian University，Deparment of Neurology，Yanji 133000，China）

ObjectiveDiscssion of Batroxobin and combined use of edaravone on acute cerebral ischemic injury.MethodsModified intraluminal middle cerebral artery occlusion（MCAO）model of cerebral ischemia reperfusion.Healthy adult male Wistar 100rats，were randomly divided into five groups，sham operation group（normal group），batroxobin in treatment group，Edaravone group，Combined treatment group.Using histochemical staining technique，detection of cerebral infarction volume；by enzymatic cycling assay，detection of Hcy levels；by immune turbidimetry，changes of hs－CRP concentration detection.Results①Determination of cerebral ischemia and cerebral infarction in rats after 24 h comparison shows the volume：batroxobin group，edaravone group，combination group and ischemia reperfusion model group，both inhibited the volume of cerebral infarction.There was significant difference among groups（P＜0.05）；there were significant difference between combination group and edaravone group，batroxobin group，（P＜0.05）；②Determination of Hcy：The ischemia reperfusion model group was significantly higher than that in normal group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of ischemia reperfusion model group（P＜0.05），edaravone group was significantly lower than that of the ischemia reperfusion model group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of edaravone group（P＜0.05），combination group was significantly lower than that of single drug group（P＜0.05）；③Determination of high sensitivity C－reactive protein：The ischemia reperfusion model group was significantly higher than that in normal group（P＜0.05），edaravone group was significantly lower than that of the ischemia reperfusion model group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of ischemia reperfusion model group（P＜0.05），batroxobin group was significantly lower than that of edaravone group（P＜0.05），combination group was significantly lower than single drug group（P＜0.05）.ConclusionTobishi batroxobin and edaravone can reduce the volume of acute cerebral infarction，and reducing the Hcy and ultra－sensitivity C－reactive protein levels，which caneffectively reduce cerebral ischemic injury，has protective effect on brain.The treatment of acute cerebral infarction two drugs is only applied in treatment or edaravone Tobishi batroxobin its therapeutic effect is more significant.

Tobishi batroxobin；Edaravone；The volume of cerebral infarction；Homocysteine；hs－CRP（Chin J Lab Diagn，2014，18：1915）

R743

：A

2014－02－18）

＊通讯作者