气相色谱-质谱法测定宝乐果（Borojo）粉中脂肪酸

张艳超，李宏，明宏艳，陈晨，高成彪，史永刚，杜臻嘉，陈倩怡，焦红

（1.增城出入境检验检疫局，广东增城511340；2.中国合格评定委员会实验室处北京100021；3.广东出入境检验检疫局，广东广州510623）

宝乐果Borojo是一种生长在南美洲热带雨林的水果，茜草科林果属，是当地特有的一种水果，Borojo有天然的调节血糖、稳定血压、增强免疫功能、改善呼吸道炎症症状、抗炎、抗氧化等功效[1]。焦红等对新鲜的Borojo的全营养素进行研究[1]，研究发现新鲜的Borojo水果成分复杂，营养物质丰富，其中水分70.99%、碳水化物25.07%、总糖7.80%、蛋白质1.5%、粗纤维2.14%。含人体必需多种微量元素如锌、铜、铁等，矿物质钾、镁、钙、磷、铁、硼、钠等也十分丰富。果肉中游离氨基酸多达 26 种，富含多种水溶性维生素 VB1、VB2、VC、烟酸和叶酸，新鲜的Borojo营养素丰富，具有较好的开发利用价值。本文对Borojo酶解浓缩粉中的油脂进行提取，采用KOH―甲醇法、H2SO4―甲醇法进行甲酯化处理，用GC－MS进行测试，分析鉴定出其中脂肪酸。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent7890GC/5975C MS型气相色谱－质谱联用仪：美国安捷伦科技公司；SHA－B双功能水浴恒温振荡器：江苏金坛亿通电子有限公司；Soxtherm索氏萃取仪：德国格哈特实验室仪器公司；DHG－9240电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；37种脂肪酸甲酯标准溶液（10 ug/mL）：美国SUPELCO公司；正己烷和甲醇色谱纯：美国TEDIA；氢氧化钾和硫酸分析纯：广州化学试剂厂。

1.2 样品制备

1.2.1 宝乐果酶解浓缩粉的制备

新鲜宝乐果清洗、去皮，分离果、核，果肉加水研磨，加果胶酶，静置1.5 h，压滤除去杂质，真空低温浓缩，调整pH，加入1%β－环状糊精，喷雾干燥成粉。

1.2.2 脂肪提取

称取20 g Borojo酶解浓缩粉装入滤纸筒，放入索氏提取器中，加入140 mL石油醚至提取瓶，设置温度170℃，浸提30min；淋洗90min，待石油醚挥发至30mL，更换加入新样品滤纸筒。从称取20 g Borojo酶解浓缩粉装入滤纸筒至抽提结束，重复操作7次。最终将抽提7次的石油醚浓缩至3 mL，将提取物转移到10 mL具塞试管，于100℃烘箱加热30 min。冷却称重，计算Borojo酶解浓缩粉出油率。

1.2.3 脂肪酸的甲酯化处理KOH―甲醇法

取60 mg Borojo油样置于10 mL具塞试管，加入0.5 mol/L KOH―甲醇溶液1.5 mL，40℃振荡30 min，静置15 min，加入2 mL正己烷，静置10 min，取上清液，用一次性过滤器通过0.22 μm的滤膜到进样瓶，上气质联用仪测定。

1.2.4 脂肪酸的甲酯化处理H2SO4―甲醇法

取60 mg Borojo油样置于10 mL具塞试管，加入2 mL 5%H2SO4―甲醇溶液，于70℃振荡60 min，加入2 mL正己烷，静置10 min，取上清液，用一次性过滤器通过0.22 μm的滤膜到进样瓶，上气质联用仪测定。

1.3 色谱－质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为HP－5毛细管柱（25m×0.20mm，0.33μm）；进样口温度：280℃；程序升温：130℃保持1 min，130℃升至180℃，升温速率：6℃/min；180℃升至220℃，升温速率：3℃/min，保持15 min；220℃升至250℃，升温速率：4 ℃/min，保持 5 min；分流比：50∶1；进样量：1 μL；载气流量：1 mL/min；溶剂延迟：3 min。

1.3.2 质谱条件

离子源：电子轰击源；离子源温度：230℃；电离电压：70 eV；接口温度：290℃；质量范围：50 m/z～500 m/z。

1.4 分析鉴定

利用GC－MS分析，通过7890GC化学工作站和标准质谱库，以及37种脂肪酸标准品进行定性分析，按面积归一化法进行定量，测得其相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 Borojo酶解浓缩粉油脂含量的测定

本方法采用索氏萃取仪进行7次油脂提取，平行试验4次，测定Borojo酶解浓缩粉平均油脂含量为0.041%。传统的索氏提取法抽提时间6 h～12 h，如重复抽提7次样品，检测周期较长。而采用索氏萃取仪可以大大提高工作效率，缩短检测周期。

2.2 不同甲酯化方法脂肪酸甲酯化效果比较

常用的甲酯化方法分为酸催化、碱催化两大类。两种方法各有其特点，可根据样品中油脂的状态选择不同的甲酯化方法。由文献资料可知[2－3]，KOH―甲醇法适用于含脂质较多样品，而H2SO4―甲醇法更适合游离脂肪酸的分析。本文比较两种甲酯化方法的甲酯化效果，如图1。

图1 两种甲酯化方法甲酯化效果比较Fig.1 Comparison of two methods effects of methyl esterification

要准确地测定各脂肪酸的组成和含量，甲酯化反应迅速、完全至关重要，不同的油脂应选择适合的甲酯化方法[2]。从图1可知：酸法鉴定出7种脂肪酸，分别是月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸和芥酸。碱法鉴定出除芥酸外的6种脂肪酸。酸法和碱法甲酯化脂肪酸的比例一致，酸法所得各脂肪酸响应值较高，脂肪酸转化率均较高于碱法，且杂质峰较少，酸法甲酯化效果优于碱法。本研究试验发现，Borojo酶解浓缩粉油脂适合采用H2SO4―甲醇法甲酯化处理，说明Borojo酶解浓缩粉油脂中游离脂肪酸较多。

2.3 Borojo酶解浓缩粉油脂中脂肪酸含量及组成

分别采用两种方法进行甲酯化处理，上气质联用仪，获得Borojo酶解浓缩粉油脂中脂肪酸含量和组成，见表1和表2。

表1 H2SO4―甲醇法脂肪酸组成及相对含量Table 1 The fatty acid composition and relative content by the method of H2SO4-Methyl alcohol

表2 KOH―甲醇法脂肪酸组成及相对含量Table 2 The fatty acid composition and relative content by the method of KOH-Methyl alcohol

由表1和表2可以看出，两种甲酯化方法处理Borojo酶解浓缩粉油脂，酸法鉴定出7种脂肪酸，碱法测试出除芥酸外6种脂肪酸，两种方法所得的脂肪酸比例一致，其中棕榈酸含量最高，其次为硬脂酸和油酸，3种脂肪酸占总峰面积的95%。月桂酸、花生酸、亚油酸和芥酸含量较低占总含量的5%。酸法鉴定出饱和脂肪酸4种，占脂肪酸总量的79.4%，不饱和脂肪酸3种，占总量的20.6%。C18酸占脂肪酸总量的43.8%，其中油酸为总量的19.28%。两种方法所检出的脂肪酸的可信度均在95%以上。

2.4 酶解浓缩加工对宝乐果中脂肪酸含量的影响

焦红[1]等对新鲜Borojo果肉脂肪酸进行研究测试，取宝乐果样品适量，用石油醚提取过滤，上安捷伦GC7890仪器测试。新鲜Borojo果肉和酶解浓缩粉脂肪酸含量如表3所示。

由表3可知，焦红[1]等报道的鲜果肉中不饱和脂肪酸含量较高，占总脂肪酸的39.53%，和酶解浓缩粉相比，其不饱和脂肪酸含量多近20%。鲜果肉中脂肪酸组成包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等9种脂肪酸。同报道的鲜果肉结果相比，酶解浓缩粉脂肪酸组成少了肉豆蔻酸、棕榈油酸、亚麻酸，但多了芥酸。鲜果肉中含量最高的是棕榈酸，其次是油酸，肉豆蔻酸和硬脂酸相当。酶解浓缩粉中脂肪酸含量与鲜果肉相比有所不同，含量最高的也是棕榈酸，其次是硬脂酸和油酸。

表3 Borojo果肉、酶解浓缩粉及其它水果脂肪酸含量比较Table 3 Comparison of fatty acid content of borojo pulp，enzyme concentrate powder and other fruit %

分析鲜果肉与酶解浓缩粉脂肪酸组成和含量不同的原因，主要在于加工工艺不同，酶解浓缩粉加工过程需要加水研磨、酶解、真空低温浓缩、喷雾干燥成粉等步骤。由于不饱和脂肪酸性质活泼，容易发生加成、双键转移、氧化、聚合等反应[4]，尤其是亚麻酸，其分子中存在3个共轭双键，有非常强的还原性，高温、空气中的氧气、紫外线以及一些重金属离子都可以将其氧化[5]，酶解浓缩粉的不饱和脂肪酸如棕榈油酸和亚麻酸在加工过程中容易发生反应，导致流失，从而测试含量较低或低于检测限。

查询文献资料可知，肉豆蔻酸在椰子新鲜果肉[6]脂肪酸中含量可达到20.45%～21.21%，而在其他水果或果实中含量很少或没有。橄榄果实[7]、苦杏仁[8]中脂肪酸组成肉豆蔻酸含量为0.9%和0.021%。番茄果实混合样品[9]、黑豆果籽[10]和葵花籽油[11]脂肪酸中不含有肉豆蔻酸。本研究采用酸法和碱法甲酯化酶解浓缩粉均未检出肉豆蔻酸，与焦红[1]等报道的鲜果中肉豆蔻酸含量为13.64%不相符，需要进一步研究。

本研究在用酸法甲酯化酶解浓缩粉时分离出芥酸，但含量较低，碱法中未检出芥酸，说明芥酸以游离脂肪酸形成存在于样品中。焦红[1]等报道的鲜果肉中无芥酸，资料中未说明甲酯化方法，可能是因甲酯化方法不同，而导致差异。

2.5 Borojo与其他水果脂肪酸比较

由表3可知，新鲜椰子肉中含有已酸、辛酸、癸酸等中链脂肪酸，中链脂肪酸具有极好的消化吸收特性，可以添加在婴幼儿食品中促进生长发育，可用作一些有脂肪吸收障碍患者以及发育不好的婴幼儿等的能源物质[12]。新鲜Borojo果肉中不饱和脂肪酸含量达到39.53%，是新鲜椰子肉的10倍。经过脱水干燥的Borojo酶解浓缩粉中不饱和脂肪酸都比椰子干[1]高。同脂肪酸含量丰富的椰子相比，宝乐果中含有人体不能合成的必需脂肪酸－亚油酸和亚麻酸，含有丰富的软脂酸、硬脂酸和油酸。亚油酸在体内可合成花生四烯酸、前列腺素等。亚麻酸在体内可合成EPA、DHA等脂肪酸。Borojo中的亚油酸含量丰富，其在体内合成的前列腺素同丰富的锌、镁、氨基酸等多种因素共同作用，对治疗哮喘、胃肠溃疡病、休克、高血压及心血管疾病，有很好的疗效。

3 结论

本文用气相色谱-质谱法测定宝乐果（Borojo）酶解浓缩粉中脂肪酸含量，确立了最佳仪器工作条件；比较H2SO4―甲醇法和KOH―甲醇法两种甲酯化方法的效果。结果表明，酸法鉴定出月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸和芥酸等7种脂肪酸。碱法鉴定出除芥酸外的6种脂肪酸。酸法和碱法甲酯化脂肪酸的比例一致，酸法所得各脂肪酸响应值较高，脂肪酸转化率均较高于碱法。本文还分析了新鲜Borojo果肉和酶解浓缩粉中脂肪酸含量及组成差异的原因；并与新鲜椰子肉、椰子干中脂肪酸做了比较。分析表明，Borojo含有较高不饱和脂肪酸，它具有降低低密度脂蛋白胆固醇的效果，可预防动脉硬化[13]，进而减少高血压，心脏病及中风等疾病发病率[4]，以Borojo为原料研制降血压、降血糖的保健食品具有较好的开发利用价值。

[1] 焦红,孟平,李丹,等.热带水果Borojo全营养素分析[J].中国食物与营养,2011,17(8):68

[2] 佘珠花.气相色谱法中油脂脂肪酸衍生化方法及其选择[J].粮食加工,2004(6):64

[3] 寇秀颖,于国萍.脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究[J].食品研究与开发,2005,26(2):47

[4] 徐文晖,王俊儒,梁宗锁.不饱和脂肪酸分离技术研究概况[J].食品研究与开发,2007,28(8):153-155

[5] 杨静,常蕊.α-亚麻酸的研究进展[J].农业工程,2011,1(1):73.

[6] 耿薇.新鲜椰子果肉脂肪酸成分的GC-MS分析[J].广东化工,2010,37(1):123

[7] 何志勇.橄榄果实中脂肪酸组成的GC/MS分析[J].安徽农业科学,2008,36(27):11805

[8] 沈宏林,向能军,高茜,等.气相色谱-质谱法分析苦杏仁中脂肪酸成分[J].理化检验化学分册,2009,45(11):1304

[9] 秦公伟,曹小勇,陈德经,等.多个番茄果实样品脂肪酸含量及组成比较分析[J].食品工业科技,2012,33(15):87

[10]张晓波.气相色谱-质谱法测定黑豆果籽中脂肪酸含量[J].粮食与油脂,2005(1):26

[11]姜波,关紫烽,范圣第,等,葵花籽油脂肪酸含量的气相色谱分析[J].大连民族学院学报,2004,6(5):36

[12]唐传核,徐建祥,彭志英.脂肪酸营养与功能的最新研究[J].中国油脂,2000,25(6):20-23

[13]黄凤洪,黄庆德,刘昌盛.脂肪酸的营养与平衡[J].食品科学,2004,25(增刊):262-265