中心组合设计法优化超声波提取芦荟甙工艺

谢贞建，颜军，魏俊，薛剑，王卫，*

（1.成都大学生物产业学院，四川成都610106；2.肉类加工四川省重点实验室，四川成都610106）

芦荟（Aloe）属多年生百合科多肉质草本植物，可药食两用[1]。新鲜芦荟不易储藏，暴露在空气中的芦荟凝胶易被氧化而失去功效[2]。芦荟的主要活性成分芦荟甙（Aloin）为多羟基蒽醌类衍生物，具有抗炎、抗辐射等功效，兼有抗氧化、抗肿瘤、调节血糖等[3-4]，其对心血管系统、免疫系统、胃损伤、肝脏等也都具有良好的保护作用，能有效地促进伤口愈合[5]，在食品[6]、医药[7]、化妆品[8]等领域具有广阔的应用前景和开发价值。

目前，常用的中草药活性成分的提取方法大多采用常温浸泡、索氏抽提、加热回流等，但这些方法提取时间长、耗费试剂量大，在实际应用中存在很大的局限性。超声波辅助提取利用超声波产生的空化效应、机械效应、热效应和其他次级效应能在不改变有效成分结构的基础上，缩短提取时间，提高提取率，在中草药活性成分的提取上得到广泛的应用[9-11]。本实验运用超声波辅助提取芦荟干粉中芦荟甙，并选用中心组合旋转设计试验和响应曲面法分析试验结果，建立芦荟甙提取的数学模型，找出最佳试验条件，在此试验条件下预测得率，并确定自变量最佳值[12-13]。为芦荟甙工业化生产提供技术参数，为芦荟资源的综合利用及副产品的有益增值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：云南库拉索芦荟（市售）；芦荟甙标准品（≥98%，中国生物制品检定所）；甲醇（HPLC级）；甲醇（AR）；无水乙醇（AR）；冰醋酸（AR）。

仪器：岛津LC-20AB型HPLC：岛津；T15RT型台式高速离心机：上海天美生化仪器设备工程有限公司；KQ3200型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；BSA124S型电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的处理

称取芦荟干粉1 g（精确到0.000 1 g），按相应料液比加入乙醇溶液，混匀，超声30 min后冷却定容，10 000 r/min离心20 min，取上清液以0.45 μm滤膜过滤，待用。

1.2.2 芦荟甙含量测定

色谱条件：色谱柱 Inertsil ODS C18（5 μm，4.6×150 mm）；流速：1 mL/min；流动相：甲醇-0.1%醋酸水=40：60；柱温：40 ℃；波长：359 nm；进样量 10 μL。

以峰面积（Y）与芦荟甙含量（X）外标法定量，回归方程Y=12 742.69X-3013.684，相关系数R2=0.9999。

1.2.3 提取时间的影响

准确称取过80目筛的芦荟干粉1.000 0 g，用75%乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，在30°C下，分别提取 10、20、30、40 min，按样品处理方法处理，用“1.2.2芦荟甙含量测定”方法测定。

1.2.4 提取温度的影响

准确称取过80目筛的芦荟干粉1.000 0 g，用75%乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，分别在30、40、50、60、70 ℃下超声提取 30 min，按样品处理方法处理，用“1.2.2芦荟甙含量测定”方法测定。

1.2.5 乙醇浓度的影响

准确称取过80目筛的芦荟干粉1.000 0 g，分别用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，在40℃下超声提取30 min。按样品处理方法处理，用“1.2.2芦荟甙含量测定”方法测定。

1.2.6 液料比的影响

准确称取过80目筛的芦荟干粉1.000 0 g，分别用80%的乙醇溶液 10、15、20、25、30、40 mL 溶解于50 mL容量瓶中，在40℃下超声提取30 min。按样品处理方法处理，用“1.2.2芦荟甙含量测定”方法测定。

1.2.7 Central Composite试验设计

在单因素基础上，选择乙醇浓度、液料比和提取温度为研究对象，并以芦荟甙含量作为响应值设计Central Composite试验。试验因素水平及编码见表1。试验辅助软件为Design Expert（version 8.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA）。

表1 Central Composite设计试验因素水平及编码Table 1 Factor level and coding of Central Composite design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 提取时间对芦荟甙含量提取的影响

按1.2.3方法考察提取时间的影响，结果见图1。由图1可知，在提取时间低于30 min时，芦荟甙含量随着提取时间的增加而增加，而大于30 min，芦荟甙含量趋于平衡，无明显变化，说明在此条件下，超声30min芦荟甙提取液已达到饱和，不会随时间的增加而增大，在后续试验中，选择提取30 min。

2.1.2 提取温度对芦荟甙含量提取的影响

按1.2.4方法考察提取温度的影响，结果见图2。

图1 提取时间对芦荟甙含量的影响Fig.1 Effect of extracted time on the yield of aloin

图2 提取温度对芦荟甙含量的影响Fig.2 Effect of extracted temperature on the yield of aloin

由图2可知，温度达到40℃时，芦荟甙含量有一个较大值。而随着温度的升高，达到60℃以上，芦荟甙含量迅速下降，原因可能是温度过高使得乙醇挥发。温度在40℃～60℃范围，都比较适合芦荟甙的提取。

2.1.3 乙醇浓度对芦荟甙含量提取的影响

按1.2.5方法考察乙醇浓度对芦荟甙含量提取的影响，结果见图3。

图3 乙醇浓度对芦荟甙含量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of aloin

由图3可知，乙醇的最佳提取浓度在80%左右，乙醇浓度太低，则溶剂的极性较小，不利于芦荟甙的溶出；而乙醇浓度太高，则溶剂中水分含量较少，不利于植物纤维的溶胀，反而降低了乙醇与芦荟的反应，从而使得芦荟甙含量降低。

2.1.4 液料比对芦荟甙含量提取的影响

按1.2.5方法考察液料比对芦荟甙含量提取的影响，结果见图4。

图4 液料比对芦荟甙含量的影响Fig.4 Effect of ethanol volume on the yield of aloin

由图4可知最佳液料比为15∶1（mL/g）。当液料比小于 15∶1（mL/g），芦荟干粉浸润不完全，芦荟甙提取不完全；当大于 15∶1（mL/g）时，芦荟甙含量变化不明显，还有略微下降的趋势，基于经济的考虑，同时较高的液料比会增加浓缩的工作量，所以选取15∶1（mL/g）。

2.2 响应面试验设计及结果

在单因素试验基础上选取乙醇浓度、液料比和提取温度3个因素做中心组合设计，以芦荟甙含量为响应值，共20个试验点，其中14个为析因点，6个为中心点。设计方案及结果见表2。

表2 中心组合设计方案及结果Table 2 Program and results of Central Composite design

利用design－expert软件对上述结果进行多元回归拟合，得到芦荟甙含量Y对乙醇浓度（A）、液料比（B）和提取温度（C）的二次多项回归方程分别为：Y=2.99－0.14A+0.048B+0.028C+0.036AB－0.019AC+0.046BC-0.17A2+5.89×10－4B2+0.015C2+0.031A2B+0.21A2B2。

2.3 模型的显著性检验

对模型进行回归方差分析及显著性检验，结果见表3，回归模型系数显著性检验结果见表4。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 回归模型显著性检验Table 4 Significance test for each term of developed regression model

由表 3 可知，模型的 F=25.22，P＜0.000 1＜0.01，说明所选用的模型具有高度的显著性。失拟项F=0.76，在 P＜0.05 上不显著（P=0.563 2＞0.05）。R2越接近 1，说明此模型越能预测其响应值[14]。模型的R2为0.971 8，表明模型拟合程度良好，预测值与实际值之间有较好的相关性。模型的校正系数RAdj2为0.933 4，表明该模型能解释93.34%的响应值的变化。模型响应值的信噪比为24.489，表明有很强的信号。

由表4可知，模型的一次项A、二次项A2极显著，交互项BC显著，二次交互项A2B2极显著，其余因素不显著，表明各种影响因素对于芦荟甙提取的影响不是简单的线性关系，其中因素A（乙醇浓度）对芦荟甙含量的提取具有很重要的作用。

图5为芦荟甙含量（Y）实测值相对回归方程预测值的偏离情况对照图。在设定的20次试验中，最小响应值为2.28 mg/g，最大响应值为3.33 mg/g。在本次试验中，预测值与实测值之间的最大偏差为：最大偏差/%=即最大偏差为2.05%。从这一方面说明采用响应曲面法进行芦荟甙的提取的试验设计所得的回归模型是可行的。

图5 实测值与模型预测值对照图Fig.5 Plot of model-predicted values against experimental values of the extraction yield of aloin

2.4 响应面交互作用分析

通过模型方程所作的等高线图见图6～图8。等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，圆形表示因素交互作用不显著，而椭圆形或马鞍形则表示两因素交互作用显著[15]。图6显示了其等高线呈马鞍形，当温度为45℃时，液料比和乙醇浓度的交互效应显著。在低乙醇浓度条件下，随着液料比的增加，其芦荟甙含量先降低后增高；而在高乙醇浓度下，芦荟甙的含量随液料比增加不明显，所以对于芦荟甙的提取，乙醇浓度不需要太高。由图7知，乙醇浓度与提取时间交互效应较显著，在较低的乙醇浓度下，需较高温度才能得到一个高的芦荟甙含量。由图8知，提取温度与液料比交互效应显著，在高液料比条件下，随着温度的增加，芦荟甙含量都是呈一个上升的趋势；在低液料比条件下，随温度的增加芦荟甙含量由高到低。而在液料比20∶1（mL/g），温度45℃可得到一较大值。

2.5 验证实验

利用软件对回归模型进行分析，选取芦荟甙含量为最大值，得最优化条件液料比 20∶1（mL/g），提取温度45℃，乙醇浓度70%下提取30 min进行验证实验。其预测值为芦荟甙含量为3.33 mg/g，在优化得到的最优条件下进行试验，平行两次结果为3.33 mg/g，3.29 mg/g，平均含量为3.31 mg/g，与预测值3.33 mg/g相差不显著，响应面法优化芦荟甙的提取工艺是切实可行的。

图6 温度为45℃时乙醇浓度与液料比对芦荟甙含量影响的等高线图Fig.6 Contour plot of the effect of concentration of ethanol and liquid-solid ratio on Alion content at temperature level of 45℃

图7 液料比为15∶1(mL/g）时乙醇浓度与温度对芦荟甙含量影响的等高线图Fig.7 Contour plot of the effect of concentration of ethanol and temperature on Alion content at liquid-solid ratio level of 15∶1（mL/g）

图8 乙醇浓度为80%时液料比与温度对芦荟甙含量影响的等高线图Fig.8 Contour plot of the effect of liquid-solid ratio and temperature on Alion content at concentration of ethanol level of 80%

3 结论

1）本实验得出芦荟干粉中芦荟甙的最佳提取条件为：液料比 20∶1（mL/g），提取温度 45 °C，乙醇浓度 70%下提取30 min。此条件下芦荟甙含量达到3.31 mg/g，经验证试验证明该工艺切实可行。

2）采用非线性数学模型拟合，复相关系数平方达到0.971 8，模型拟合程度良好，预测值与实际值之间有较好的相关性，在本次试验中，预测值与实测值之间的最大偏差为2.05%。

3）通过回归模型显著性检验和依据模型方程所作的等高线可以看出，乙醇浓度的一次项和二次项都非常显著，是影响芦荟甙提取的一个重要的因素，对于芦荟甙的提取，乙醇浓度不需要太高。液料比和提取温度交互效应较显著，各种影响因素对于芦荟甙提取的影响不是简单的线性关系。

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