葡萄籽粉对高脂膳食大鼠肝脏抗氧化功能影响

宋春梅，杜鹃，李善姬，刘敏

（吉林医药学院，吉林 吉林132013）

葡萄籽是葡萄酒厂的下脚料，含有多种营养成分和生物活性物质，具有较高的营养价值和药用价值[1-2]。目前的研究结果表明，葡萄籽提取物具有抗氧化、清除自由基、抗炎、预防动脉粥样硬化和心血管疾病的作用[3-6]。对于葡萄籽粉的营养保健作用研究报道较少。本文通过对高脂膳食大鼠肝组织抗氧化能力及肝细胞超微结构的影响，为葡萄籽做为天然保健食品提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 葡萄籽粉制备

吉林市市售葡萄籽，磨成粉，过40目筛。

1.2 动物分组

wistar雄性大鼠，体重190g～210g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，大鼠购回后，适应性饲养一周后进行实验。将大鼠按体重随机分为5组：对照组、高脂模型组、低、中和高剂量葡萄籽粉组，每组12只。分笼饲养，每笼5只，每日自然光照，室温22℃～25℃。

实验开始后对照组给予基础饲料，其余各组给予高脂饲料喂养。对照组和高脂组灌胃蒸馏水，低、中和高剂量葡萄籽粉组分别按照标准人剂量20 g/60 kg的1倍、5倍和10倍的葡萄籽粉的量配成不同的浓度进行灌胃，连续灌胃28 d，每周称体重一次，记录大鼠的体重，调节葡萄籽粉灌胃剂量。

饲料组成：基础饲料为玉米粉35%、大豆粉30%、面粉25%、麸皮10%，另加多种维生素和无机盐。高脂饲料为79%基础饲料组成，1%胆固醇，10%猪油，10%蛋黄粉。

1.3 仪器和试剂

TD-5A离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；FA1104N电子天平：上海精密科学。Hitachi-7650透射电镜：日立公司；超薄切片机：徕卡UC7。

SOD和MDA试剂盒：南京建成试剂公司。

1.4SOD活性和MDA含量测定

实验结束后，大鼠禁食12h，以10%乌拉坦7mL/kg腹腔麻醉后，打开腹腔，取出肝脏，称重，制备10%肝组织匀浆液，采用试剂盒测定SOD和MDA，测试方法严格按照试剂盒内说明书进行。

1.5 10%肝组织匀浆液制备

称取肝组织块1 g，放到冰冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干称重。加入冷生理盐水9 g，电动玻璃匀浆机匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，分装于EP管中，冰箱保存。

1.6 肝脏电镜标本制备

各组随机取大鼠4只，将大鼠麻醉，固定在解剖台上，开腹暴露肝脏，取同一部位肝组织，用冰生理盐水漂洗，将其切成1×1×1 mm3组织块，置于4℃2.5%戊二醛4%多聚甲醛固定液中，1%锇酸后固定，梯度丙酮脱水，Epon812包埋，徕卡UC7超薄切片机切片，透射电子显微镜Hitachi-7650进行观察照相。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 葡萄籽粉对大鼠体质量、肝质量和肝系数的影响

葡萄籽粉对大鼠体质量、肝质量和肝系数的影响见表1。

表1 葡萄籽粉对大鼠体重、肝重和肝系数的影响（n=12，±s）Table 1 The effects of grape seed powder on body weight，liver weight and liver index in male rats

表1 葡萄籽粉对大鼠体重、肝重和肝系数的影响（n=12，±s）Table 1 The effects of grape seed powder on body weight，liver weight and liver index in male rats

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由表1可知，大鼠喂养4周后体质量均有明显增加，各组大鼠体重均增高，但各组间大鼠体重比较，均无统计学差异（p＞0.05）。高脂模型组肝脏重量和肝指数均高于对照组和葡萄籽粉组，各组间相互比较，均无显著性差异（p＞0.05）。

2.2 葡萄籽粉对大鼠肝脏SOD活性和MDA含量的影响

葡萄籽粉对大鼠肝脏SOD活性和MDA含量的影响见表2。

表2 葡萄籽粉对大鼠肝脏SOD活性和MDA含量的影响（n=8，±s）Table 2 The effects of grape seed powder on the activity of SOD and the contents of MDA in liver tissues of rats

表2 葡萄籽粉对大鼠肝脏SOD活性和MDA含量的影响（n=8，±s）Table 2 The effects of grape seed powder on the activity of SOD and the contents of MDA in liver tissues of rats

注：与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与高脂模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。

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表2结果表明，高脂模型组和葡萄籽粉各组大鼠SOD活性均高于对照组，与对照组比较均有显著差异（P＜0.05，P＜0.01）；高脂模型组与葡萄籽粉各剂量组比较，葡萄籽粉中和高剂量组有显著差异（P＜0.05）。MDA含量高脂模型组最高，与对照组和葡萄籽粉各组比较，均有显著差异（P＜0.01）。

2.3 葡萄籽粉对高脂膳食大鼠肝细胞超微结构的影响

正常对照组：肝细胞呈多边形，核1个～2个，呈圆形，核仁明显，核内常染色质多，胞质内可见丰富的粗面内质网、线粒体和糖原颗粒，线粒体嵴清晰，可见少量的溶酶体颗粒。肝细胞胆小管可见，其腔面有微绒毛，小管两端的紧密连接清晰，肝细胞的肝血窦面有微绒毛，小管两端的紧密连接清晰，血窦内皮细胞呈扁平形，核扁椭圆形，核内异染色质多（见图1～图2）。

图1 对照组肝脏电镜结构×1000Fig.1 Electron microscopic structure of liver tissue of control group×1000

图2 对照组肝脏电镜结构×2000Fig.2 Electron microscopic structure of liver tissue of control group×2000

高脂模型组：肝细胞体积变小，细胞的界限不清，核呈圆形，1个～2个，核内异染色质略增多，呈块状，核基质轻度空化，胞质基质致密，粗面内质网排列紧密，膜增厚，线粒体呈致密状，嵴不易分清，可见大小不一的圆形脂滴和少量吞噬体。胆小管两端的紧密连接不易分辨，腔面有微绒毛数量增多，结构不清晰，肝细胞血窦面微绒毛结构消失，呈絮状（见图3～图4）。

图3 高脂模型组肝脏电镜结构×700Fig.3 Electron microscopic structure of liver tissue of high lipid group×700

图4 高脂模型组肝脏电镜结构×2000Fig.4 Electron microscopic structure of liver tissue of high lipid group×2000

葡萄籽粉组：肝细胞排列紧密，细胞界限隐约可见，肝细胞核圆形，可见双核，部分肝细胞的核基质呈轻度致密状，胞质内粗面内质网成堆分布，排列紧密；线粒体较多，呈小圆形，嵴呈致密状。可见散在分布的糖原颗粒；胞质内脂滴数量较高脂模型组略减少，部分肝细胞胞质基质呈致密状。胆小管数量较多，腔面微绒毛多。肝细胞超微结构变化较模型组高脂模型组轻（见图 5～图 6）。

图5 葡萄籽粉组肝脏电镜结构×700Fig.5 Electron microscopic structure of liver tissue of grape seed powder group×700

图6 葡萄籽粉组肝脏电镜结构×2000Fig.6 Electron microscopic structure of liver tissue of grape seed powder group×2000

3 讨论

在正常生理情况下，机体内源性自由基不断的产生，产生的自由基可通过体内酶促防御系统如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等清除，使机体内的自由基保持在低浓度的动态平衡中，通常不会对机体造成损伤。一旦氧自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，体内氧自由基代谢就会出现失衡，这就会引发脂质过氧化。脂质过氧化是活性氧自由基损伤机体的重要途径之一。大量研究[7]已显示，高脂膳食能够使血脂水平升高，脂代谢紊乱，生物体氧化反应增强，导致体内氧化-抗氧化状态失衡，发生氧化损伤。MDA是脂质过氧化的产物，机体内MDA的水平间接说明了细胞和组织受损伤的程度。SOD能有效的清除超氧阴离子自由基，代表了机体的抗氧化能力。本研究结果表明，中和高剂量葡萄籽粉组SOD活性高于高脂模型组，葡萄籽粉各组MDA含量显著下降。这表明葡萄籽粉可通过提高酶类抗氧化物质来调节氧化应激水平。

高脂饮食导制肝脏脂类代谢异常，产生胰岛素抵抗，使胰岛素抑制脂肪分解的作用降低，促使脂肪分解加强，游离脂肪酸（FFA）增多，升高的脂肪酸可使肝细胞线粒体通透性加大并引起肿胀，肝细胞发生变性、炎细胞浸润、甚至坏死等。同时也可以引起自由基增多，增多的自由基与生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应而引起膜结构的改变。研究表明，高脂膳食肝细胞的超微结构变化：肝细胞基质稀疏，高度脂质化，充斥着大量脂肪空泡，线粒体和粗面内质网等细胞器结构紊乱，数目明显减少，线粒体嵴大部分融合、消失，核染色质凝集[8-9]。本研究证实，高脂膳食大鼠肝细胞也有相似的结构变化，补充葡萄籽粉可使肝细胞超微结构损伤减轻。主要是葡萄籽具有降低血脂水平，改善脂代谢紊乱，提高SOD活性，降低MDA含量，保护肝细胞结构。

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