齐墩果酸、丹酚酸对UUO大鼠肾及肾小管功能的影响*

张 翼 李 丽 何立群

（1.上海市长宁区中心医院，上海 200336；2.上海市曙光医院，上海 200336）

齐墩果酸、丹酚酸对UUO大鼠肾及肾小管功能的影响*

张 翼1李 丽1何立群2△

（1.上海市长宁区中心医院，上海 200336；2.上海市曙光医院，上海 200336）

目的观察抗行灵方的主要药用成分齐墩果酸和丹酚酸在单侧输尿管梗阻（UUO）模型大鼠肾间质纤维化（RIF）过程中的作用及机制。方法健康雄性SPF级SD大鼠48只，随机分为4组，其中假手术组、UUP模型组、齐墩果酸组、丹酚酸组各12只。造模后第28日腹主动脉采血检测血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN），收集24 h尿液，检测24 h尿蛋白定量、取肾组织，HE染色比较各组肾小管间质损伤程度。结果 在UUO模型中，丹酚酸和齐墩果酸在延缓实验大鼠肾功能衰竭中的功能和侧重各有不同，除假手术外各组大鼠肾功能出现失代偿，尿微量蛋白排泄增多，肾间质纤维化加重；与假手术组、模型组相比，齐墩果酸组SCr、NAG、24 h尿蛋白定量的水平显著降低；丹芬酸组BUN、NAG、α1-M、24 h尿蛋白定量的水平显著降低 （P＜0.05或P＜ 0.01）。结论丹酚酸及齐墩果酸单体均能够保护肾功能，降低血肌酐和尿素氮，并在一定程度上减少尿微量蛋白的排泄。

齐墩果酸 丹酚酸 单侧输尿管梗阻模型 肾功能 肾小管功能 肾间质纤维化 抗纤灵方丹参 川牛膝

慢性肾脏疾病（CKD）已经成为全球性公共健康问题，呈现高发病率、低知晓率的特点［1］。终末期肾病（ESRD）是各种CKD进展的最终结局，其发病率逐年增长，且治疗费用昂贵。单侧输尿管梗阻（UUO）模型是目前较为成熟的一种研究肾间质纤维化的实验动物模型［2］。并且啮齿类动物的纤维化特征与人类相似［3］。抗纤灵方是本文通信作者何立群教授的经验方，其治疗慢性肾功能衰竭效果良好［4-6］。本实验应用UUO大鼠模型，观察其主要药用成分齐墩果酸、丹酚酸单体在改善UUO大鼠肾功能及肾小管功能上的作用及机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠48只，体质量（180±20）g，由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供，实验动物许可证号SYXK（沪）2004-0005；实验动物合格证号0058668。由上海中医药大学实验动物中心饲养，12 h光照，相对湿度45％，自由饮水饮食。适应性喂养1周。

1.2 药物及试剂 丹酚酸（批号110420），齐墩果酸（批号110531），均购自上海融禾医药科技有限公司，予4℃冰箱保存。24 h尿蛋白定量 （批号E-30705），α1-MG（批号E-30124），β2-MG（批号E-30066），TRF（批号E-30682），NAG（批号E-30484）试剂盒均购自上海科医联创生物科技有限公司。

1.3 分组与造模 48只大鼠随机分为4组，分为假手术组、模型组、丹酚酸组和齐墩果酸组，每组12只。造模方法：3％戊巴比妥钠（1.5 mL/Kg）腹腔注射麻醉后，右侧卧位于手术台上，局部剃毛，以碘伏常规消毒，取左侧左肋脊角处附近为手术切口，逐层分离，暴露左侧肾脏，分离左侧输尿管，在输尿管中段两端各用丝线结扎，不剪断输尿管，然后缝合。假手术组除不结扎输尿管外，余手术步骤相同。

1.4 给药方法 假手术组、模型组予生理盐水5 mL/（kg·d）灌胃。丹酚酸组及齐墩果酸组给药浓度为2 mg/mL，丹酚酸组按10 mg/（kg·d）的剂量灌胃，齐墩果酸组按6 mg/（kg·d）的剂量灌胃，每毫升含单药有效成分剂量相当于60 kg体质量成人每日临床用量的10倍。共干预4周。

1.5 标本检测 假手术组及UUO模型各组于造模后第28日处死所有大鼠。腹主动脉采血，用于指标测定。血样经离心后留取血清。血尿素氮、肌酐的测定，用BECMAN-⊿5大型生化仪常规生化测定方法检测。各组大鼠于造模后第28日置于代谢笼中收集24 h尿。尿标本酶联免疫法检测尿NAG、α1-M、RBP、β2-M含量。检测方法严格按照试剂盒说明书，主要仪器为M5多功能酶标仪。

1.6 统计学方法 应用SPSS15.0统计软件。计量资料以（±s）表示；采用单因素方差分析，应用Levene检验进行方差齐性检验，组间样本两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠SCr、BUN的含量比较 见表1。3个造模组较假手术组术后SCr、BUN均有显著升高 （P＜0.05）；与模型组比较，齐墩果酸组SCr及BUN均有明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；丹酚酸组SCr及BUN亦均有明显减低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠SCr、BUN的含量比较（±s）

表1 各组大鼠SCr、BUN的含量比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 BUN 24 h尿蛋白定量假手术组 4.23±0.39 0.30±0.10 n SCr 12 25.30±6.98模型组 7.59±1.74△ 0.94±0.32△12 44.09±7.14△齐墩果酸组 12 34.45±2.50*△ 6.66±0.56*△ 0.39±0.10**△丹酚酸组 12 35.40±6.47*△ 5.84±0.80**△ 0.54±0.21**△

2.2 UUO模型中尿微量蛋白变化 见表2。模型组的尿TRF、α1-M、NAG、β2-M含量与假手术组比较有显著升高（P＜0.05）。齐墩果酸组与模型组比较仅尿α1-M含量均有明显下降（P＜0.01），NAG、β2-M、TRF水平无下降。丹酚酸组与模型组比较尿α1-M及NAG含量都有明显下降（P＜0.01），β2-M、TRF水平无下降。

表2 各组α1-MG水平比较（ng/L±s）

表2 各组α1-MG水平比较（ng/L±s）

组别 n丹酚酸组 12假手术组 12模型组 12齐墩果酸组 12 α1-MG（ng/L） NAG（U/L）β2-MG（ng/L）TRF（nmol/L）206.19±15.60**△25.88±4.91*△ 36.83±1.75△ 216.35±19.78△196.61±9.43 19.16±2.04 35.07±2.69 172.52±50.17 226.00±15.25△ 37.21±17.33△ 38.68±1.92△ 239.33±26.27△204.20±9.02**△ 29.74±6.89△ 36.45±3.65△ 222.96±29.90△

3 讨论

肾纤维化是各种原因的CKD发展至ESRD的最后共同途径和主要的病理基础。研究表明，肾间质纤维化可较肾小球病变更能预示肾脏损伤的预后［7］。

抗纤灵冲剂由丹参、川牛膝等组方，其主要有效成分为丹酚酸和齐墩果酸。本实验中，齐墩果酸可以降低肾衰竭大鼠SCr水平，减少24 h尿蛋白总量，也可降低模型大鼠血BUN水平；丹酚酸可以降低肾衰竭大鼠血BUN水平，减少24 h尿蛋白总量，降低模型大鼠SCr水平，说明齐墩果酸、丹酚酸分灌胃可改善肾衰竭模型大鼠的肾小球滤过率，对肾小管重吸收功能也能起到改善作用。

抗纤灵冲剂药味精简，功主活血祛瘀、扶正祛浊。在临床应用中表现了较好疗效。观察表明，抗纤灵冲剂能显著降低患者SCr、BUN水平，其效果优于包醛氧淀粉［4］，并有明显的改善肾脏血流动力学作用［5］；其近期疗效优于福辛普利，对于早中期慢性肾功能衰竭疗效显著［6］。

近年来尿液中的生物标志物的检测引起关注，有学者认为可以替代肾活检术判断疾病的进展、监测治疗反应及判断预后［8］。α1-MG、NAG、β2-MG和TRF就是常用的尿液生物标志物。其中N-乙酰-B-D氨基葡萄糖苷酶（NAG）是广泛存在于各组织的溶酶体中的一种高分子质量（140000）酶。在肾近端小管上皮中含量最高，在正常情况下，血清中的NAG不能通过肾小球滤过膜，当肾近端小管上皮细胞受损时，溶酶体内的NAG释放入尿而使尿中NAG升高［9］，因此，尿中NAG活性升高与肾小管（主要是近端小管）损伤密切相关。α1-MG是由人体的肝脏和淋巴细胞合成、分子量约为33000道尔顿的糖蛋白，血液中游离的α1-MG可自由通过肾小球滤过膜，多在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量从终尿排出，一般认为α1-MG在及尿液中增高的原因为肾小管重吸收和代谢α1-MG的能力降低，以及肾小球滤过功能受损。目前人们普遍认为血清及尿液中α1-MG的测定可作为反映肾小管重吸收功能受损的一项灵敏指标。β2-MG是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，正常β2-MG的合成率及从细胞膜上的释放量相当恒定，可以从肾小球自由滤过，多在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中分解破坏；故而正常情况下β2-MG的排出是很微量的，其测定主要用于监测近端肾小管的功能［10］。正常情况下，血浆相对分子质量＜60000的蛋白质较容易通过肾小球滤过膜，并几乎被近端肾小管完全吸收和降解，而TRF由于分子质量较大，相对分子质量约为77000，加之由于膜电荷的选择屏障作用，一般不从肾小球滤过膜滤出。但当肾小球的滤过屏障受损时，尿中的TRF可明显升高。TRF被认为是更早更敏感地反映肾小球滤过膜损伤的标志性蛋白［11］。目前研究认为，对肾脏损伤的检测指标，联合检测的阳性率要高于各指标的单独检测［12］。

有研究表明，发现UUO后大鼠尿NAG及β2-MG均显著升高［13］。本研究发现，在UUO模型中，丹酚酸仅在降低UUO模型大鼠的尿α1-MG、NAG水平上有作用，对尿TRF、β2-M无明显降低作用，而齐墩果酸仅在降低UUO模型大鼠的尿α1-MG水平上有作用，对尿NAG、β2-M、TRF无明显降低作用，提示丹酚酸和齐墩果酸在改善肾衰竭肾的肾小管重吸收功能上存在一定作用，但作用机制还有待研究。根据以往的观察，抗纤灵冲剂能减少UUO模型中的尿微量蛋白尿，改善模型中的肾损伤［14］。丹酚酸和齐墩果酸在实验数据上看却并不能较全面地改善UUO模型中的尿微量蛋白含量，提示抗纤灵冲剂的减少尿微量的作用机制可能为其他药味的作用或其协同作用，这有待于进一步的研究得出结论。

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Effects of Oleanolic Acid and Salvianolic Acid on Rats′Kidney and Renal Tubular

ZHANG Yi，LI Li，HE Li-qun.Tongren Hospital Affliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Objective：To observe clinical effects of Kangxianling Decoction on kidney protection and to investigate function and mechanism of oleanolic acid and salvianolic acid on UUO rat model during renal interstitial fibrosis.M ethods：48 healthy male SPF Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group，model group，oleanolic acid group and salvianolic acid group，12 in each group.Levels of serum creatinine（SCr），blood urea nitrogen（BUN），24 hpro from 24 h urine，HE staining，and nephridial tissue were collected and compared for the damage after 28 days.Results：In UUO model，oleanolic acid and salvianolic acid played different roles and functions in delaying renal failure.Except for sham-operated group，renal function of rats in other groups was deteriorated while excretion of urine micro protein gradually increased and renal interstitial fibrosis gradually deteriorated.Compared with sham-operated group and model group，the levels of SCr，NAG，and 24hpro reduced significantly while in oleanolic acid group the levels of SCr，NAG，24 hpro and α1-M lowered too（P＜ 0.05或P＜0.01）.Conclusions：Oleanolic acid and salvianolic acid can improve renal function and renal tubular function，reduce Scr and UN，and decrease the excretion of urine micro protein.But the mechanisms are different.【Key words】Oleanolic acid；Salvianolic acid；Unilateral ureteral obstruction model；Renal function；Renal tubular function

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0569-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.002

国家科技重大专项资助课题（2009ZX09311-003）△通信作者

2013-12-28）