LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅲ)

陈峰，李海龙，谭银丰，赖伟勇

(1.海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南 海口 571101；2.海南医学院药学院，海南 海口 571101)

LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅲ)

陈峰1,2，李海龙1,2，谭银丰1,2，赖伟勇1,2

(1.海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南 海口 571101；2.海南医学院药学院，海南 海口 571101)

目的研究大鼠灌胃缩泉胶囊后益智中二芳基庚烷类成分(益智酮甲、益智酮乙、益智醇)在大鼠胆汁中的物质形式。方法雄性Sprague Dawley大鼠胆管插管手术完毕经灌胃给予缩泉胶囊(1.64 g/kg)后收集0～4 h胆汁。同体积(100 μl)的两份胆汁样品分别经蛋白沉淀和β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH为5的乙酸钠缓冲液)处理后，所得样品利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS)进行分析。结果在大鼠胆汁中几乎检测不到益智二芳基庚烷类成分的原形物质形式，而是以葡萄糖醛酸结合物的形式存在。这些二相代谢物经酶水解处理后代谢物的色谱峰消失，释放出二芳基庚烷类成分的原形物质。结论大鼠灌胃给药后经肠道吸收的二芳基庚烷类成分在胆汁中形成葡萄糖醛酸结合产物，酶水解可以释放出原形物质形式。本研究可以帮助我们理解这类物质的体内转运过程，也为后期的定量分析工作奠定基础。

缩泉胶囊；益智；二芳基庚烷类；液相色谱-质谱联用仪

缩泉丸源于宋代《魏氏家藏方》[1]，由益智仁、乌药和山药组成，用于治疗多尿、尿频、遗尿，被2010版《中国药典》一部收载[2]，是治疗尿失禁的为数不多的中药之一。方中以益智仁温补肾之阳，固气涩精为君药。缩泉丸在国内9家企业生产(其中8个为水丸，1个为胶囊)，其中缩泉胶囊在2012年的销售额达到5 000万元。缩泉丸多成分体内过程研究较为薄弱，机体如何处置缩泉丸中的化学物质尚待阐明。本课题组前期分析了缩泉丸中主要成分的含量[3]，并对大鼠灌胃缩泉丸后主要成分益智酮甲在大鼠系统中的暴露进行了初步研究[4]。针对君药中黄酮类物质的胆汁排泄已经进行了研究(另文发表)，本文主要探讨二芳基庚烷类成分在大鼠胆汁中的物质形式，以了解这类物质的体内转运过程。

1 材料与方法

1.1 试药益智酮甲、益智酮乙和益智醇购自凯方医药科技(上海)有限公司，以上化合物的纯度均在98%以上，结构、分子式和分子量见图1。β-葡萄糖醛酸水解酶(HP-2型，来自海曼蜗牛，每毫升含有100 000 U的β-葡萄糖醛酸水解酶和7 500 U的硫酸酯酶水解酶)购自Sigma公司。缩泉胶囊购自湖南汉森药业有限公司(批号110602)。

图1 益智酮甲、益智酮乙和益智醇的结构式

1.2 实验动物、给药和样品采集同“LC-MS/ MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅰ)”。

1.3 胆汁样品的处理甲醇沉淀：同“LC-MS/ MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅰ)”。酶水解：同“LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅱ)”。

1.4 LC-MS/MS分析方法

1.4.1 色谱条件同“LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅰ)”。

1.4.2 质谱条件质谱条件同“LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅰ)”。益智酮甲、益智酮乙和益智醇检测离子对分别为313.2→136.9，311.2→117.0和315.3→137.0。上述3个二芳基庚烷类成分的二相代谢产物的检测离子对分别为益智酮甲葡萄醛酸化代谢物489.2→313.2，益智酮甲硫酸酯结合物393.2→313.2，益智酮乙葡萄醛酸化代谢物487.2→311.2，益智酮乙硫酸酯结合物391.2→311.2，益智醇葡萄醛酸化代谢物491.3→315.3和益智醇硫酸酯代谢物395.3→315.3。

2 结果

2.1 胆汁中益智酮甲的测定大鼠灌胃缩泉胶囊后，胆汁样品经甲醇沉淀后，检测不到益智酮甲的原形物质(保留时间为6.90 min)，主要是益智酮甲的葡萄糖醛酸结合物(保留时间为5.72 min)，见图2。相同来源的胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸结合物被水解，释放出益智酮甲的原形物质，见图3。

2.2 胆汁中益智酮乙的测定大鼠灌胃缩泉胶囊，胆汁样品经甲醇沉淀后益智酮乙的原形物质(保留时间为7.14 min)几乎检测不到，可以检测到益智酮乙的葡萄糖醛酸结合物(保留时间为5.57 min)，见图4。大鼠胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸结合物被水解，释放出益智酮乙的原形物质(保留时间7.11 min)，但响应比较低，见图5。

图2 甲醇沉淀处理后益智酮甲及二相代谢产物的测定

图3 酶水解处理后益智酮甲及二相代谢产物的测定

图4 甲醇沉淀处理后益智酮乙及二相代谢产物的测定

图5 酶水解处理后益智酮乙及二相代谢产物的测定

2.3 胆汁中益智醇的测定大鼠灌胃缩泉胶囊，胆汁样品经甲醇沉淀后检测不到益智醇的原形物质(保留时间为6.88 min)，主要是益智醇的葡萄糖醛酸结合物(保留时间为5.71 min)，结果见图6。胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸结合物被水解，释放出益智醇的原形物质，见图7。

图6 甲醇沉淀处理后益智醇及二相代谢产物的测定

图7 酶水解处理后益智醇及二相代谢产物的测定

3 讨论

二芳基庚烷类成分(益智酮甲、益智酮乙和益智醇)是益智的代表性化学成分，也是缩泉胶囊中一类主要活性物质。益智酮甲和益智酮乙具有抗炎、抗肿瘤、抗菌和胃保护作用[5-9]。在缩泉胶囊中益智酮甲是益智酮乙含量的20倍以上，而益智酮乙和益智醇含量相当[3]。大鼠灌胃给予缩泉胶囊后，血浆中检测到微量的游离型益智酮甲，未检测到益智酮乙[4]。这些成分有可能存在明显的首过消除。

通过本文的研究，我们发现在大鼠胆汁样品中几乎检测不到游离型的益智酮甲、益智酮乙和益智醇，这些物质多转化为葡萄糖醛酸结合物。经β-葡萄糖醛酸水解酶孵化处理，释放出原形物质形式。尽管如此，益智酮乙的响应也是很低的，一方面是因为制剂中的含量较低。另一方面，在大鼠体内，这些二芳基庚烷类成分存在代谢转化，益智酮乙还原为益智酮甲，再还原为益智醇(另文发表)。

因此，益智二芳基庚烷类成分在大鼠体内存在明显的胆汁消除。本文的研究可以帮助我们理解这类物质的体内转运过程，也为定量分析工作奠定基础。

[1]孙世发.缩泉丸方来源浅析[J].中医杂志,1994,35(7):439.

[2]国家药典委员会.《中国药典》2010版.北京:中国医药科技出版社.2010:1218.

[3]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation SuoQuan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[4]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[5]Lin RJ,Yen CM,Chou TH,et al.Antioxidant,anti-adipocyte differentiation,antitumor activity and anthelmintic activities against Anisakis simplex and Hymenolepis nana of yakuchinone A from Alpinia oxyphylla[J].BMC ComplementAltern Med,2013,13:237.

[6]Yamazaki R,Hatano H,Aiyama R,et al.Diarylheptanoids suppress expression of leukocyte adhesion molecules on human vascular endothelial cells[J].Eur J Pharmacol,2000,404(3):375-385.

[7]Chun KS,Park KK,Lee J,et al.Inhibition of mouse skin tumor promotion by anti-inflammatory diarylheptanoids derived from Alpinia oxyphylla Miquel(Zingiberaceae)[J].Oncol Res,2002,13(1):37-45.

[8]Chun KS,Kang JY,Kim OH,et al.Effects of yakuchinone A and yakuchinone B on the phorbol ester-induced expression of COX-2 and iNOS and activation of NF-kappaB in mouse skin[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol,2002,21(2):131-139.

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Identification of metabolites in bile of rat with Suoquan Capsules using LC-MS/MS(Ⅲ).

CHEN Feng1,2,LI

Hai-long1,2,TAN Yin-feng1,2,LAI Wei-yong1,2.
1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo identify the diarylheptanoids(yakuchinone A,yakuchinone B and oxyphyllacinol) and their metabolites in rat bile after oral administration of Suoquan capsules.MethodsCannulas were surgically inserted into the bile duct of male Sprague-Dawley rats(n=3)under anesthesia(pentobarbital,50 mg/kg,i.p.)and bile was collected for 4 h after oral administration of Suoquan capsules(1.64 g/kg,suspended in 0.5%w/v sodium carboxymethycellulose).After methanol precipitation or β-glucuronidase(1 000 units/ml in pH 5 acetate buffer)treatment, these chemicals and their phaseⅡmetabolites in rat bile samples were analyzed via liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)with selected reaction monitoring mode.ResultsThe parent compounds could not be measured in rat bile sample treated by methanol precipitation.On the contrast,glucuronidated metabolites were recovered in rat bile.After enzymatic hydrolysis treatment via β-glucuronidase,the corresponding parent chemicals were librated from their conjugated forms.ConclusionAfter oral administration,the absorbed diarylheptanoids were partly biotransformed to glucuronide conjugates and excreted into rat bile.This study is helpful for better understanding of these diarylheptanoids’fates in rat and quantitative analysis of these compounds in rat bile samples in the future.

Suoquan Capsules;Alpinia oxyphylla(Yizhi);Diarylheptanoids;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）17—2503—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0981

2014-03-04)

2011年海南省自然科学基金项目(编号：812189，813188，813196)，海南医学院青年培育基金项目(编号：HY2012-013)

赖伟勇。E-mail：13807660389@163.com