Ghrelin及其受体在大鼠心肌梗死后的动态表达

袁明杰，孔彬，胡红耀，权力，王鑫，梁锦军，唐艳红

(武汉大学人民医院心血管内科，湖北武汉 430060)

·论著·

Ghrelin及其受体在大鼠心肌梗死后的动态表达

袁明杰，孔彬，胡红耀，权力，王鑫，梁锦军，唐艳红

(武汉大学人民医院心血管内科，湖北武汉 430060)

目的Ghrelin是近年发现的一种新的生长激素释放肽，具有心血管保护效应。本研究旨在观察心肌梗死(MI)后Ghrelin及其受体GHSR-1a的动态表达及其变化。方法30只SD雄性大鼠，随机分为四组，分别为假手术组(6只)，心肌梗死后3 d组(8只)，梗死7 d组(8只)，梗死28 d组(8只)。采用冠状动脉结扎法制作心肌梗死模型，假手术组只在冠状动脉下穿线，但不结扎。采用实时定量PCR方法检测梗死边缘心肌Ghrelin及GHSR-1a mRNA表达，免疫印迹法检测梗死边缘心肌Ghrelin及GHSR-1a蛋白表达及分布。结果与假手术组比较，MI后3 d、7 d、28 d梗死周边区域心肌中Ghrelin mRNA表达明显降低(P＜0.05)，且呈逐渐下降趋势；而GHSR-1a mRNA表达显著增加(P＜0.05)；梗死3 d组与梗死7 d组差异无统计学意义(P＞0.05)。免疫印迹显示假手术组大鼠心肌显示出了较强的Ghrelin阳性表达，而心肌梗死后Ghrelin阳性表达明显降低(P＜0.05)；与此相反，GHSR-1a蛋白表达在梗死后明显增加(P＜0.05)。结论Ghrelin/GHSR-1a系统在梗死后心脏重构中可能起着重要作用，并可作为防止心脏重构的一个新的干预靶点。

Ghrelin；GHSR-1a；心肌梗死；心脏重构

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是临床常见的心血管系统疾病之一，死亡率高。随着诊疗技术的提高，目前生存率得到了显著的提高，但是心肌坏死后将进一步引起心室重构、心律失常和心力衰竭。MI后心脏的一系列变化时动态进展与压力负荷增加、交感神经活性增强及RAS系统的活化密切相关，多种炎症介质也参与其中。心功能的进行性下降，最终导致心力衰竭。

Ghrelin是一种促生长激素释放激素，作为内源性的配体，能与体内生长激素促分泌素受体(GHSR)相结合，发挥生理功能[1]。以往的研究显示，Ghrelin具有多种心血管保护功能，包括：抗炎作用[2-3]，舒血管效应[4]，调节心肌细胞能量代谢，改善心脏恶病质等[5-6]。

充分的了解MI后Ghrelin及其受体的动态变化有利于明确Ghrelin心脏保护作用的作用靶点，帮助阐明其作用机制，为其药用价值的开发提供基础研究依据。本实验旨在通过建立大鼠MI模型，观察不同时间段心肌组织中Ghrelin及其受体的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物30只成年雄性SD大鼠，10周龄，体重为(250±30)g，由武汉大学医学动物中心提供。采用随机数字的方法被随机分为四组：假手术组6只，心肌梗死组24只(心梗后3 d组、7 d组及28 d组，每组各8只)。实验动物在武汉大学人民医院动物房SPF环境中喂养，饲养环境符合实验条件要求。

1.2 主要试剂3%戊巴比妥钠，北京化工厂；DEPC处理水，碧云天生物技术研究所；Trizol购自美国Invitrogen公司；Marker及引物由上海生工合成；PCR试剂盒购自武汉众一生物科技公司；Ghrelin及GHSR-1a多克隆抗体，Abcam公司；HRP标记羊抗兔多克隆抗体，碧云天生物技术研究所；S-P免疫组化试剂盒购自深圳晶美生物科技公司。

1.3 主要仪器小动物实验器械，上海手术器械厂；小动物呼吸机(TKR-200C型)，江西特力麻醉呼吸设备公司；LEAD-2000B32道电生理记录仪，中国四川锦江通用实业有限公司；压力换能器，上海益联科教设备有限公司；MDF392超低温冰箱，日本三洋公司；低温高速离心机，德国Heraeus公司；荧光定量PCR扩增仪，Biometra；VL凝胶成像分析系统

1.4 模型制作大鼠称重后，用3%戊巴比妥钠以30 mg/kg的剂量经腹腔注射麻醉，待呼吸平稳后，将大鼠后背位固定于实验用木板上，将心电图针形电极插入四肢皮下，用肢体导联进行心电图监测。颈部皮肤备皮，常规消毒。于左心耳根部下方2 mm处结扎冠状动脉前降支。在肺动脉圆锥和左心耳之间进针，进针深度0.5 mm，以6/0缝线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎侧出针，并观察心电图变化。如发现结扎线以下区域立刻变成暗红色，同时I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于0.2 mV并持续0.5 h以上，则说明结扎成功。术后挤压胸腔，排出残留空气，清除胸腔内积血，逐层缝合关闭胸腔。待动物苏醒后拔除气管插管，缝合颈部切口。术后每天肌肉注射青霉素40万U，共3 d，预防感染。假手术组，只在开胸暴露心脏后，在冠脉前降支下穿线，而不结扎。

1.5 标本留取分别在术后3 d、7 d及28 d迅速处死动物，迅速处死动物，取出心脏，用生理盐水洗净。沿房室环剪去左右心房及右室游离壁。沿着心脏长轴，从结扎点将左心室剪成两半。一半立刻保存在-80℃冰箱，作为后面的Real-time PCR研究。另一半在4%中性福尔马林中固定后作为免疫组化研究。梗死边缘区界定为梗死疤痕外0.5～1.0 mm。为了避免混淆梗死边缘区及非梗死区左室心肌，在留取标本时，梗死边缘区外1～2 mm心肌被去除掉。

1.6 实时定量PCR取心肌组织100～150 mg，加入1 ml TRIZOL，冰上匀浆，提取总RNA，采用PCR试剂盒扩增目的基因。引物序列设计如下：Ghrelin，上游5'-GAAGCCACCAGCTAAACTGC-3'，下游5'-TGCTGGTACTGAGCTCCTGA-3'；GHSR-1a，上游5'-CTCGGATCTGCTCATCTTCC-3'，下游5'-GGAAGC AGATGGCGAAGTAG-3'；用GAPDH(100 bp)作为参照，其引物序列为：上游5'-GCAAGTTCAACGGCACAG3-'，下游5'-ATTTGATGTTAGCGGGAT-3'。PCR反应仪设置条件为94℃5 min，其后以94℃变性10 s；58℃退火10 s，72℃延伸5 s，循环45个周期，最后72℃4 min终止。反应完成后计算机自动分析ct值。根据溶解曲线和产物电泳结果判断反应产物特异性。目的基因相对GAPDH的含量表达采用2-⊿⊿CT方法计算[7]。

1.7 免疫组化研究切片经常规二甲苯、梯度乙醇脱蜡后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min×3次。浸入新鲜配置的3%H2O2溶液10～15 min以封闭内源性过氧化物酶活性，并行酶消化抗原修复。滴加正常山羊血清，室温孵育10～15 min以封闭荷电点，直接在切片上滴加Ghrelin及GHSR-1a多克隆抗体(工作浓度1:100)，37℃孵育1 h后转入4℃冰箱，放置24 h。PBS洗涤后滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育20 min，滴加试剂SABC，37℃孵育40 min。最后镜下DAB显色，PBS终止反应。经苏木素复染后脱水，树胶封片。显微镜下观察阳性表达密度在总面积中所占的比例。

2 结果

2.1 心肌Ghrelin mRNA与GHSR-1a mRNA表达的动态改变Ghrelin和GHSR-1a扩增曲线及溶解曲线见图1(A-D)，扩增产物电泳结果见图2。结果显示，与假手术组比较，MI后3 d、7 d至28 d梗死周边区域心肌中Ghrelin mRNA表达明显降低(P＜0.05)，且呈逐渐下降趋势；但梗死3 d组与梗死7 d组差异无统计学意义(P＞0.05)。与假手术组比较，MI后3 d、7 d至28 d梗死周边区域心肌中GHSR-1a mRNA表达显著增加(P＜0.05)，且随着梗死时间的延长，其表达量呈逐渐升高趋势(P＜0.05)，见图1～4。

图1 Ghrelin扩增曲线(A)及溶解曲线(B)，GHSR-1a扩增曲线(C)及溶解曲线(D)。目的基因溶解曲线都只有一个高峰，提示引物设计特异，扩增高效。

图2 A Ghrelin mRNA电泳图；B GHSR-1a mRNA电泳图

2.2 心肌Ghrelin及其受体GHSR-1a的表达及分布如图3所示，假手术组大鼠心肌显示出了较强的Ghrelin阳性表达，而心肌梗死后3 d、7 d及28 d，Ghrelin阳性表达明显较假手术组降低(P＜0.05)；GHSR-1a在正常心肌中表达量很少，而心肌梗死后GHSR-1a表达明显增加，且随着时间延长，其表达量呈逐渐升高趋势，见图4(P＜0.05)。

图3 Ghrelin免疫表达

图4 GHSR-1a免疫表达

3 讨论

Ghrelin最早是日本学者在动物的胃内分离得到的，主要在胃肠组织表达，在全身其他组织也有分布[8]。Ghrelin的生物学效应部分是通过其受体GHSR介导。(GHSR)为G蛋白耦联受体，广泛分布于下丘脑、垂体、心脏、胰腺、肠、脂肪组织、性腺等多种组织器官，主要包括GHSR-1a和GHSR-1b两种亚型，Ghrelin经过乙酰化后主要与GHSR-1a结合发挥作用。研究发现Ghrelin在心脏细胞本身及血管内皮细胞中可自身合成，而GHSR在心血管组织中也有表达，这提示Ghrelin可能直接对心血管系统发挥作用[3，9]。

目前Ghrelin对心血管的作用效应还存在争论。心肌细胞可以生成和分泌Ghrelin。近期研究表明Ghrelin可以促进人类胚胎干细胞在梗死心肌环境中生存和分化[10]。通过激活GHSR-1a，Ghrelin对缺血心肌细胞产生保护效应，防止缺血再灌注损伤及防止恶性心律失常的发生[11-12]。Ghrelin也可以改善缺血心肌的能量代谢并且防止血管紧张素诱导的心肌损伤。然而也有学者提出了不一样的意见，Ghrelin直接注射并不能对GH缺乏的患者产生心血管效应，且动物研究也发现Ghrelin并不能改善心功能及减小心脏扩大[13-14]。

本研究成功制作了大鼠心肌梗死模型。通过研究发现，在心肌梗死后，随着时间的延长，梗死区域及梗死周边区域的Ghrelin表达量是动态降低的，于28 d明显降低。而梗死区及梗死周边区GHSR-1a的表达量则是动态升高的，于28 d明显升高。上述这些动态变化将减弱Ghrelin的心血管保护作用，而损伤因子持续存在，最终导致心衰的发生。也有研究认为在严重心衰患者中，血浆Ghrelin水平是降低的，且与增加的生长因子及炎症因子呈正相关[15]，笔者推测血浆Ghrelin水平增高可能是对心肌组织Ghrelin表达的代偿反应。

生长激素释放激素GHRH可以直接激活GHSR-1a高脂营养诱导的心肌细胞重构伴随着增加的GHSR-1a表达，PI3K及Akt[16]。我们推测增加的GHSR-1a表达可能会对心脏重构起保护作用，但是Ghrelin系统在心血管中的保护机制尚不清楚。进一步可研究Ghrelin过表达对心脏重构及心力衰竭的影响。

本研究尚存在一些不足之处，如没有确切计算梗死面积，进一步Ghrelin及GHSR-1a的空间分布及相关关系尚需要进一步明确。总体来说，Ghrelin/GHSR-1a系统可能在心血管系统中发挥积极的作用，但具体机制尚不明确。

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Expression of Ghrelin and its receptor in rats after coronary artery ligation.

YUAN Ming-jie,KONG Bin,HU Hong-yao,QUAN Li,WANG Xin,LIANG Jin-jun,TANG Yan-hong.Department of Cardiology,Wuhan University Renmin Hospital,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveGhrelin is a novel growth hormone-releasing peptide,which has been shown to exert beneficial effects on cardiac function and ventricular remodeling.The present study aimed to investigate the expression of ghrelin and the growth hormone(GH)secretagogue receptor 1a(GHSR-1a).MethodsAfter ligation of the anterior descending artery(LAD),adult male Sprague-Dawley rats were randomized to 3 d,7 d and 28 d groups,with eight rats in each group.Another six rats underwent thoracotomy and pericardiotomy,but not LAD ligation(Sham group).Expressions of both ghrelin and GHSR-1a were assessed by means of immunohistochemistry and real-time PCR.ResultsCardiac expression of ghrelin increased on day 3,7 and 28 compared with the sham group(P＜0.05).In contrast,the GHSR-1a mRNAlevels increased during the same days(P＜0.05).Decreased expression of ghrelin and increased expression of GHSR-1a were also observed in infarcted heart.ConclusionThe ghrelin/GHSR-1a system may play an important role in regulating cardiac remodeling after MI and provide a potential pharmacological target for treating cardiac remodeling.

Ghrelin;GHSR-1a;Myocardial infarction;Cardiac remodeling

R-332

A

1003—6350（2014）16—2341—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0916

2014-03-10)