BAALC蛋白在急性白血病中的表达及其临床意义

董小林，张少君，邱桂华，廖雪梅，杨洁

（湖北医药学院附属人民医院健康体检中心，湖北十堰 442000）

BAALC蛋白在急性白血病中的表达及其临床意义

董小林，张少君，邱桂华，廖雪梅，杨洁

（湖北医药学院附属人民医院健康体检中心，湖北十堰 442000）

目的探讨脑和急性白血病胞质(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)蛋白在急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)的表达及其临床意义。方法采用Western blot方法半定量检测BAALC蛋白在58例AML患者(初诊24例、完全缓解28例和复发6例)的骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)的表达水平，15例非恶性血液病患者以及AML细胞系KG1α和HL-60分别作为阴性和阳性对照。结果KG1α和HL-60细胞BAALC均为阳性高表达，非恶性血液病对照者BAALC表达均为阴性。BAALC阳性率在AML初诊组(83.3%)与复发组(100%)均高于完全缓解(CR)组(7.1%)和阴性对照组(0)(P＜0.001)；AML初诊组和复发组的BAALC蛋白相对含量明显高于CR组和阴性对照组(P＜0.01)，且CR组和阴性对照组之间BAALC表达阳性率和相对含量差异无统计学意义(P＞0.05)。结论BAALC蛋白在AML中表达水平异常增高，提示BAALC可能与AML的发生发展密切相关。

急性髓系白血病；BAALC；完全缓解

脑和急性白血病胞质(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)基因定位于人类染色体8q22.3，最初是在伴有8号染色体三体的AML中鉴定出来的[1]。正常情况下，BAALC基因主要表达在神经组织(如：脑、脊索)和神经外胚层来源组织(如肾上腺、甲状腺、脾脏)及造血前体细胞如CD34+的早期造血细胞[2]，编码的蛋白质在高等哺乳动物中的表达高度保守。近年来研究发现，BAALC mRNA在急性髓系白血病高表达，与AML患者的预后切相关，被认为是AML预后较差的指标之一[3-6]。目前，尚未发现BAALC基因编码的蛋白与目前已知的蛋白有同源性，且BAALC蛋白在AML中的表达研究较少，功能尚不明确。我们采用Western blot方法半定量检测了AML细胞系KG1α和HL-60以及58例AML患者骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)中的BAALC蛋白表达，并收集了AML患者的临床资料，追踪观察临床疗效，并了解不同病情(初诊、完全缓解、复发)AML患者BAALC的表达水平，初步探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料病例来自2010年3月至2012年8月期间我院血液科住院或者门诊随访AML患者58例，男性33例，女性25例，中位年龄45岁(21～69岁)。AML的诊断、完全缓解、复发标准按张之南主编《血液病诊断及疗效标准》[7]，其中初诊24例(M02例，M29例，M32例，M511例)，完全缓解(CR)28例(M28例，M38例，M510例)和复发6例(M01例，M23例，M52例)。初诊的AML患者接受诱导缓解治疗，包括DA(柔红霉素+阿糖胞苷)、IA(去甲柔红霉素+阿糖胞苷)、NV(米托蒽醌+卫萌)等化疗方案，M3首选全反式维甲酸+DA。获得CR的患者随后给予巩固治疗、维持治疗或进行造血干细胞移植。非恶性血液病患者15例作为阴性对照，其中巨幼细胞性贫血3例，缺铁性贫血(IDA)6例，特发性血小板减少性紫癜(ITP)6例。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂人淋巴细胞分离液(Ficoll，北京西美杰科技有限公司)，PIPAⅠ型全蛋白抽提试剂盒(美国DBI Bioscience)，BCA蛋白含量检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)，兔抗人BAALC多克隆抗体(美国Abcam)，β-actin抗体和二抗(HRP标记羊抗兔IgG)(美国Santa Cruz)，PVDF蛋白印记膜(美国MilliPore)，ECL化学发光试剂盒(美国Pierce)。

1.2.2 AML细胞系与细胞培养KG1α细胞和HL-60细胞购自中科院上海细胞库。HL-60细胞和KG1α细胞分别接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2～3 d传代，取处于对数生长期的细胞进行实验，作为本研究的阳性对照组。

1.2.3 标本采集及单个核细胞分离抽取骨髓液2～5 ml，用肝素抗凝，以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后加入人淋巴细胞分离液(Ficoll)上，离心20 min，分离得到单个核细胞，PBS洗涤两次，细胞沉淀于-80℃冻存备用。

1.2.4 Western blot检测按照RIPA全蛋白抽提试剂盒的说明提取细胞总蛋白，用BCA蛋白含量检测试剂盒进行蛋白定量。以每孔40 μg上样，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转至PVDF膜上，5%BSA室温封闭1 h。BAALC抗体(1:1 200)4℃孵育过夜，以β-actin抗体(1:2 000)为内参照，二抗IgG-HRP(1:4 000)室温孵育1 h，TBST振荡洗涤，加入ECL发光液显色曝光。实验重复3次。用Image-Pro Plus 6.0软件分析BAALC与β-actin的灰度比值代表BAALC蛋白的相对含量。

1.3 统计学方法应用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，组间均数的比较采用LSD检验，率的比较采用Pearson Chi-Square(χ2)检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BAALC蛋白在非恶性血液病对照者和AML细胞系中的表达15例非恶性血液病对照者BAALC蛋白BAALC相对含量为(0.041±0.032)，均为阴性。在KG1α和HL-60白血病细胞株中BAALC均为高表达，BAALC相对半定量值(BAALC/β-actin灰度比)分别为(3.247±0.640)和(1.842±0.385)(n=3，图1A)。根据阳性对照组、阴性对照组以及实验组中BAALC蛋白表达水平，该实验中选定BAALC/β-actin灰度比值≥0.1为高表达，＜0.1为低表达，以此计算BAALC表达的阳性率。

2.2 AML患者BAALC蛋白的表达AML患者BAALC蛋白表达阳性率在初诊组(83.3%)和复发组(100%)均高于CR组(7.1%)和阴性对照组(0)(P＜0.001)，CR组和阴性对照组差异无统计学意义(χ2值= 0.09，P=0.764)。采用Pearson Chi-Square(χ2)检验比较不同组间BAALC蛋白的表达水平，CR组与阴性组比较，差异无统计学意义(P=0.122)，而初诊组和复发组BAALC蛋白明显低于CR组和阴性对照组(P＜0.05)。有3例AML患者在疾病的不同时期检测出BAALC的高表达：1例M5患者BAALC/β-actin初诊时为1.353，CR时为3.329，且随访该患者CR后4个月复发；1例M2a患者初诊时为2.629，经化疗达完全缓解后，BAALC表达量将至0.173；另1例M2患者CR时为0.087，复发时为1.376(图1B)。

图1 BAALC在AML患者和细胞系中的表达情况

3 讨论

白血病的发生和发展与多种相关致癌基因过表达或(和)抑癌基因失活有关，其中某些基因的异常表达起关键作用。BAALC基因是近年来研究发现的与AML的发生和预后有密切关联的重要基因之一。BAALC基因最初发现在神经外胚层来源的组织中表达，随后研究发现来自骨髓的CD34+祖细胞也表达BAALC mRNA，在骨髓祖细胞分化过程中，BAALC的表达水平不断下调[8-9]，而且BAALC基因主要表达于这两种组织和细胞。Tanner等[1]研究发现AML、ALL及CML急变期患者可检测到BAALC基因的高表达，而CML慢性期患者及CLL患者则检测不到。国内研究者采用实时荧光定量PCR技术检测到正常成人骨髓中也存在BAALC mRNA的低表达[10]。研究表明，BAALC mRNA在新诊断的正常核型AML高表达，与完全缓解失败、原发性耐药和明显短的总生存和高的复发率有关[11-12]，被认为是AML患者的预后不良指标。也有研究报道在成人前体B细胞ALL患者中，BAALC基因过表达的患者也具有较差的总生存率[13-14]。前述研究主要集中于研究BAALC基因mRNA表达水平与AML的预后关系，而BAALC蛋白在AML发生发展过程中所起的作用尚不清楚。

我们用Western blot方法检测了BAALC蛋白在KG1α和HL-60白血病细胞系、AML患者以及非恶性血液病患者对照BM-MNCs中的表达。结果表明，BAALC蛋白在KG1α和HL-60细胞均呈高表达，在非恶性血液病对照组表达极低甚至不能测出，而在AML患者初诊、完全缓解和复发不同病情时表达程度差异较大，初诊和复发患者BAALC蛋白明显高于完全缓解患者和非恶性血液病患者，且完全缓解和非恶性血液病患者之间表达差异无统计学意义。本研究中发现，1例AML患者BAALC在初诊时BAALC表达已有升高，复发时BAALC表达进一步升高；另1例AML患者初诊时BAALC表达升高，经治疗达CR后BAALC表达下降。

BAALC蛋白的功能研究报道较少。有研究者成功构建BAALC基因的表达载体分别转染人HL60/ADM、MOLT-4和K562细胞株筛选得到稳定过表达该基因细胞系，发现BAALC基因能促进HL60/ADM细胞株的增殖、抑制凋亡及增加HL60/ADM细胞株拮抗As203诱导凋亡的能力[15]。BAALC基因沉默后能抑制KG1α细胞的增殖和诱导细胞凋亡[16]。表明BAALC基因可能在AML的发生发展过程中起促进作用。

综上所述，BAALC在AML的发生、进展及演变过程中可能发挥了重要作用，从而有可能成为AML治疗的新靶点。

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Expression significance of BAALC in acute myeloid leukemia.

DONG Xiao-lin,ZHANG Shao-jun,QIU Gui-hua, LIAO Xue-mei,YANG Jie.Physical Examination Center,People's Hospital Affiliated to Hubei Medicine College,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and its significance of brain and acute leukemia cytoplasmic(BAALC)in acute myeilod leukemia(AML).MethodsBAALC level was assessed by Western blot in the bone marrow mononuclear cells(BM-MNCs)of 58 AML patients,including 24 newly diagnosed patients,28 complete remission patients and 6 relapsing patients,15 nonmalignant hematopathy patients as negative controls and AML cell line KG1α and HL-60 as positive controls.ResultsThe expression of BAALC was positive in KG1α and HL-60 cells but negative in 15 negative controls.The BAALC positive rate in AML newly diagnosed group(83.3%) and relapsing group(100%)was higher than that in complete remission(CR)group(7.1%)and negative control group (P＜0.001).BAALC relative amount in AML newly diagnosed group and relapse group was significantly higher than that in CR group and negative control group(P＜0.01).The positive rate and relative amount of BAALC showed no statistically difference between CR group and negative controls.ConclusionBAALC is overexpressed in AML patients,suggesting that BAALC is associated with the development ofAML.

Acute myeloid leukemia;BAALC;Complete remission

R733.71

A

1003—6350(2014)05—0639—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0250

2013-05-28)

杨洁。E-mail：146653354@qq.com