榄香烯诱导裸鼠移植瘤凋亡的作用机制研究*

屠洋洋 俞耀军 林海鸿 林宪慧 孙维建 卢明东 周 香 余俊华 郑志强

（温州医科大学附属第二医院，浙江 温州 325000）

榄香烯诱导裸鼠移植瘤凋亡的作用机制研究*

屠洋洋 俞耀军 林海鸿 林宪慧 孙维建 卢明东 周 香 余俊华 郑志强△

（温州医科大学附属第二医院，浙江 温州 325000）

目的 观察榄香烯对裸鼠胃癌移植瘤的作用并探讨其相关机制。方法 雄性裸鼠建立人胃癌SCG-7901细胞裸鼠移植瘤模型，随机分为对照组、榄香烯组、PD98059组、榄香烯和PD98059联合组（榄香烯+PD98059组）。对比榄香烯和PD98059对裸鼠胃癌移植瘤的作用，测量对比裸鼠胃癌移植瘤的大小及药物对裸鼠生长的抑制作用。Western-blot方法检测各组ERK1/2蛋白、p-ERK1/2、p-P38蛋白的表达情况。结果 3个实验组在治疗后移植瘤大小与对照组比较明显减小，榄香烯组较对照组p-ERK1/2蛋白表达显著增多，3个治疗组相比对照组p-p38蛋白表达显著增加，两药联合比单一药物作用显著（均P＜0.05或P＜0.01）。结论 榄香烯和PD98059都能促进肿瘤组织凋亡，其中榄香烯促进裸鼠胃癌移植瘤凋亡可能与p-ERK1/2蛋白和p-p38蛋白上调有关，而PD98059促进裸鼠胃癌移植瘤凋亡可能与p-P38蛋白上调有关。

裸小鼠 移植瘤 榄香烯 PD98059 凋亡

胃癌目前仍以手术治疗为主，但非手术治疗越来越受研究者关注，特别是中药在晚期胃癌综合治疗中的作用更是研究热点。榄香烯是从活血化瘀中药莪术挥发油中提取的抗癌有效成分［1］，其主要生物学活性为阻滞细胞周期，诱发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长［2］，但具体机制尚未明确，有待进一步探究。本研究观察榄香烯对裸鼠胃癌移植瘤的作用并探讨其相关机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物和细胞株 裸鼠（Balb/cnu/nu）4～6周龄，体质量18～20g，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，编号SCXK（沪）2012-0002。人胃腺癌SGC-7901细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。

1.2 药品和试剂 RPMIl640培养基（美国Gibco公司）；榄香烯注射液（国药准字H10960114，大连华立金港制药业有限公司）；ERK1/2信号通路抑制剂PD98059（美国Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；0.9％氯化钠注射液（温州医科大学附属第二医院），兔抗人REK1/2及p-REK1/2一抗、兔抗人p-P38、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司），PrimeScript RT reagent Kit（日本Takara公司），SYBR Green（美国罗氏公司）。

1.3 动物分组、给药和模型制作 将裸鼠（Balb/cnu/nu）随机分为4组：对照组、榄香烯组、PD98059组及联合组（榄香烯+PD98059组），每组5只。常规培养SGC-7901细胞，取对数期生长的细胞，以5×106个/200μL的肿瘤细胞悬液，注射于裸鼠背部，每只0.2mL。3周后，肿瘤可触及时，开始药物处理。榄香烯（榄香烯浓度根据相关文献结合前期的预实验）不论是单用药还是与PD98059联合用药，均使用最大耐受剂量（PD980591mg/kg、榄香烯200mg/kg）；对照组给予0.9％氯化钠注射液。两药联合应用时，用药间隔时间为0.5h。所有药物每周腹腔注射2次，共5次。

1.4 实验方法 细胞培养，采用10％胎牛血清、2％的双抗（青霉素和链霉素）的RPMI1640培养基、在37℃、CO2体积分数为5％、相对湿度95％条件下培养胃癌SGC-7901细胞株，取对数生长期细胞进行动物实验。裸鼠处死后，按对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组分别取心、肺、肝、肾组织标本经10％中性甲醛固定后包埋切片，行HE染色，以观察用药后各组心、肺、肝、肾组织的病理学改变，了解对比转移情况。Western-blot法，按对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组4组移植瘤，通过组织提取出蛋白，并计算出上样量。制取SDS聚丙烯胺凝胶垂直电泳，转膜，脱脂牛奶封闭，TBTS洗膜，孵一抗，再TBTS洗膜，孵二抗，再次TBTS洗膜，涂上ECL发光液，进行曝光，检测各组ERK1/2、p-ERK1/2和p-P38蛋白的表达情况。RT-PCR法，分别将对照组、PD98059组、榄香烯组和榄香烯+PD98059组的移植瘤剪碎，用匀浆机对4组移植瘤进行研磨，Trizol法提取RNA，溶解于20mL DEPC水，做好标记。进行RNA浓度的测定，确保OD260/OD280在1.8～2.0之间，以说明RNA的纯度够高。通过计算出来的RNA浓度，根据测出来的RNA浓度进行配平，按Takara逆转录试剂盒说明书进行逆转录，得到cDNA。采用10μL的体系：SYBRGreen5μL、DDH 3μL、上下游引物各0.5μL（capase-3上游引物：5-TGACTGGAAAGCCGAAACTC-3。下游引物：5-GCA AGCCATCTCCTCATCA-3。Bax上游引物：5-ATGCGT CCACCAAGAAGC-3。下游引物：5-CAGTTGAAGTT GCCATCAGC-3。bcl-2上游引物：5-CGACTTCTT CAGCATCAGGA-3。下游引物：5-TGAGCCACAGGGA GGTTCT-3。内参基因β-actin上游引物：5-ATATC GCTGCTGGTCGTC-3。下游引物：5-AGGATGGCGTGA GGGAGAGC-3）、cDNA 1μL。根据上述体系进行PCR扩增，检测capase-3、bax、bcl-2 3个凋亡相关基因在3个实验组和对照组之间的差异，有无统计学意义（实验组与对照组的差异根据2-ΔCt法计算）。

1.5 观察方法 每3～4日测量1次体质量、皮下瘤的大小，包括长径a和短径b（mm），并计算皮下瘤的体积，体积（V）＝4/3×π×r3，r=（a+b）/4。停药解剖剥离肿瘤，称瘤重及体质量，计算抑瘤率，同时取各组裸鼠心、肺、肝、肾组织。根据瘤细胞接种的天数和移植瘤的体积绘制肿瘤的生长曲线。绘制肿瘤生长曲线——瘤细胞接种天数-移植瘤体积关系。计算抑瘤率（IR），IR=（1-治疗组瘤重/对照组肿瘤瘤重）×100％。无明显肿瘤或虽有小的残余结节但是显微镜检查未发现有肿瘤细胞的裸鼠被认为是完全治愈（CR）。

1.6 统计学处理 应用SPSS 18.0统计学软件。裸鼠的移植瘤体积以（±s）表示，进行方差齐性检验后分别成组t检验和t’检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物对裸鼠体质量增长的作用 见表1。对照组裸鼠的体质量相比2周前的体质量增加显著（P＜0.01），PD98059组裸鼠的体质量相比2周前的体质量无显著变化（P＞0.30），榄香烯组裸鼠给药2周后体质量增加显著（P＜0.03），榄香烯+PD98059组注射药物后的裸鼠与2周前体质量差异无统计学意义（P＞0.40）。

表1 药物对人胃腺癌裸鼠体质量的影响（±s）

表1 药物对人胃腺癌裸鼠体质量的影响（±s）

与治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

剂量（mg/kg） 体质量增加（g）等体积的生理盐水 1.76 1mg/kg 0.82体质量（g）始末20.64±1.016322.40±0.7382*20.50±1.2903 21.32±1.3700组别 n对照组 5 PD98059组 5 200mg/kg 1.56 20.66±1.001422.22±0.8348*榄香烯组 5榄香烯+PD98059组 5 200mg/kg+1mg/kg 20.36±1.1653 21.02±1.2397 0.66

图1 对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组裸鼠移植瘤在21～33d之间体积的大小

2.2 药物对移植瘤生长的影响 见图1和表2。对照组裸鼠移植瘤体积从21～33d增长显著；PD98059组裸鼠移植瘤体积相比对照组增长稍缓慢；榄香烯组裸鼠移植瘤的体积增长被抑制，且有减小的趋势；联合组与对照组比较，移植瘤的体积有缩小的趋势，对移植瘤的生长的抑制作用较榄香烯组更为显著。

图2 肿瘤细胞处理3周后拍摄的裸鼠移植瘤

表2 4组移植瘤在21～33d之间的体积（cm3）

2.3 药物对胃癌移植瘤的治疗作用 根据抑瘤率的计算公式，PD98059组抑瘤率为38.15％，榄香烯组抑瘤率为56.72％，榄香烯+PD98059组抑瘤率为75.59％。分析PD98059组与对照组相比，抑瘤作用不明显（P＞0.05），榄香烯组抑瘤作用明显；对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组的瘤重分别为（0.7890±0.3150）g、（0.4880±0.1314）g、（0.3414±0.2187）g、（0.1898±0.0885）g，瘤重差异显著（P＜0.05）；榄香烯+PD98059组抑瘤率最高，抑制作用最为显著（P＜0.01）。

2.4 形态学检测结果 见图3。将4组动物处死后，取下各组的肝肾心肺组织，用10％的多聚甲醛固定，做石蜡切片，行HE染色，每组动物每种器官组织各切片20张，以观察动物肿瘤细胞的转移情况，并未发现癌细胞。

图3 肝肾心肺组织HE染色（×100倍）

2.5 药物对ERK1/2蛋白表达的影响 见图4。对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组这4组总ERK1/2蛋白的表达依次为（2.2351±1.6828）、（2.0433±1.4598）、（2.2494±1.7144）、（2.2956±1.7546）。两两比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

图4 对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组裸鼠移植瘤的ERK1/2蛋白表达情况

2.6 药物对p-ERK1/2蛋白表达的影响 见图5。对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组p-ERK1/2蛋白表达依次为（0.1599±0.0320）、（0.1089±0.0652）、（0.3090±0.0934）、（0.1635±0.0230），PD98059组与对照组相比，p-ERK1/2蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与对照组比较，榄香烯组p-ERK1/2蛋白表达增加（P＜0.01）；而榄香烯+PD98059组与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组裸鼠移植瘤的p-ERK1/2蛋白表达情况

2.7 药物对p-P38蛋白表达的影响 见图6。对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组p-P38蛋白表达依次为（0.2044±0.0808）、（0.4078±0.1972）、（0.4227±0.0357）、（0.7922±0.0527）。3个实验组与对照组相比，p-P38蛋白表达显著增加（P＜0.01）；而榄香烯+PD98059组与单药组相比较，p-P38蛋白的表达增加更加显著（P＜0.01）；PD98059组与榄香烯组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组裸鼠移植瘤的p-P38蛋白表达情况

2.8 运用PCR检测4个不同动物组的Bax、Bcl-2、Caspase-3基因的表达情况 见表3。对照组、PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组Bax基因的表达呈递增，两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.01）；Bcl-2基因则是呈递减的趋势，两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.01）；而Caspase-3也呈递增趋势，两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表3 不同动物组移植瘤之间的Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA的表达（±s）

表3 不同动物组移植瘤之间的Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA的表达（±s）

各组之间根据2-ΔCt值进行比较，P＜0.01。

组别Bax Bcl-2 Caspase-3 ΔCt 2-ΔCt ΔCt 2-ΔCt ΔCt 2-ΔCt对照组 -0.8360±0.050 1.7866±0.0630.1733±0.045 0.8870±0.028 -0.9366±0.035 1.9144±0.046 PD98059组 -1.0500±0.050 2.0713±0.0720.5066±0.050 0.7041±0.024 -1.2600±0.040 2.3955±0.066榄香烯组 -1.2533±0.055 2.3850±0.0910.9333±0.042 0.5237±0.015 -1.4766±0.065 2.7849±0.125联合组 -1.6500±0.026 3.0966±0.1191.5833±0.049 0.3338±0.011 -1.8566±0.047 3.6230±0.119

3 讨论

目前认为中药抗肿瘤主要通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，影响肿瘤细胞蛋白质、核酸的合成，阻滞肿瘤细胞的分裂周期，抑制拓扑异构酶和端粒酶的活性等几个方面发挥抗肿瘤作用［3］。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）广泛地存在于各种细胞中，在信号传导过程中起着重要的作用［4］，主要调控细胞周期的运行和基因表达。研究显示榄香烯通过MAPK信号通道起作用，但具体通过MAPK中哪条通道起作用，还有待研究［5-8］；Liu等研究发现榄香烯通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进其的凋亡［9］。所以我们构建裸鼠移植瘤模型，通过肿瘤生长曲线的绘制和抑瘤率计算发现3个药物组裸鼠的皮下瘤相对对照组都一定的抑制作用，且两药联合组抑制作用最显著。通过测量体质量发现榄香烯组与对照组对裸鼠的体质量生长差异不大，而PD98059组、榄香烯+PD98059组和对照组的裸鼠体质量生长差异显著，且这两组裸鼠体质量增长缓慢，说明是PD98059对裸鼠的生长有一定的影响，而榄香烯这种中成药对裸鼠的生长的影响很小，所以设想榄香烯对人体的生长代谢影响也会很小，为临床治疗肿瘤提供一种新思路。通过对裸鼠的心肺肝肾做大量的石蜡切片，HE染色观察其病理变化，发现4组裸鼠的心肺肝肾组织切片差异不大，并未找到瘤细胞转移，可能未切到有瘤细胞转移的组织或者瘤细胞转移的很少，基本上不转移，推断皮下移植瘤细胞转移到肝肾心肺器官的可能比较小。本研究发现4组裸鼠总ERK1/2蛋白表达差异不显著，榄香烯组与对照组相比p-ERK1/2蛋白表达增加，说明榄香烯是通过ERK1/2蛋白的磷酸化抑制移植瘤的增殖。PD98059组较对照组p-ERK1/2蛋白表达降低与Kalous J相符［10］，认为PD98059可以抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，榄香烯+PD98059组与对照组相比p-ERK1/2蛋白表达增加不显著，说明PD98059对ERK1/2的作用恰好与榄香烯相反，抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，这结果与PD98059是ERK1/2的特异性阻滞剂恰恰相符。PD98059组、榄香烯组、榄香烯+PD98059组相较对照组p-P38蛋白表达增加，而且榄香烯+PD98059组p-P38蛋白表达增加较PD98059组和榄香烯组两组更为显著，说明无论榄香烯或PD98059都可以促进P38蛋白的磷酸化且榄香烯和PD98059上调p-P38蛋白表达作用可以叠加，与研究相符合［11-12］。

Caspase家族和bcl-2家族是调节凋亡发生的两大关键家族，caspase-3基因是最重要的凋亡执行之一，抑制caspase-3可以保护或者降低细胞的凋亡，激活capase-3可以导致凋亡增加［13］，bcl-2为凋亡抑制基因，bax为促凋亡基因［14］。通过RT-PCR检测发现，按对照组、PD组、榄香烯组、联合组顺序，bax基因和caspase-3基因都呈递增趋势，而bcl-2基因却呈递减趋势，研究表明榄香烯可以通过上调p-ERK1/2蛋白和p-P38蛋白的表达，从而促进bax基因和caspase-3基因表达增加以及bcl-2基因表达降低抑制移植瘤的增殖和诱导移植瘤的凋亡，PD98059可以抑制ERK1/2蛋白的磷酸化和上调p-P38蛋白的表达，上调bax基因和caspase-3基因及下调bcl-2基因，与诱导移植瘤的凋亡有关，与相关文献一致［15-16］。

综上所述，榄香烯可以抑制肿瘤组织的生长及诱导其凋亡，其作用机制可能是通过激活p-ERK1/2和p-P38两种信号通路；而PD98059也可以抑制肿瘤组织的生长及诱导其凋亡，作用机制可能是通过激活P38信号通路诱导凋亡，但具体p-ERK1/2和p-P38两种通道在抑制肿瘤组织的生长及凋亡方面有何种作用和联系尚未清楚，有待进一步的研究和考证。

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The Mechanism of Elemene Inducing Apoptosis of Nude Mice Transplanted Tumor

TU Yangyang，YU Yaojun，LIN Haihong，et al.
The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou 325000，China

Objective：To observe the effect of elemene inducing nude mice transplanted tumor and to explore the relative mechanism.Method：male nude mice were chosen to establish SCG-7901 gastric transplanted tumor model and were divided into four groups：control group，elemene group（maximum tolerated dose of 200mg/kg），PD98059 group（maximum tolerated dose 1mg/kg），elemene and PD98059 joint group.The effect of elemene and PD98059 on nude mice gastric transplanted tumor were compared，and the size of transplanted tumor were measured and the inhibitive effect on the growth of nude mice were determined.ERK1/2，P-ERK1/2 and P-P38 protein expressions of each group were detected by Western blot method.Result：The size of nude mice transplanted tumors of three experimental groups significantly decreased after treatment compared with control group.And PERK1/2 protein expression of elemene group was more obvious than that of the control group.P-P38 protein expression of three treatment groups increased much more significantly than that of the control group.Elemene and PD98059 combined treatment group had more obvious effect than single drug group.Conclusion：Both elemene and PD98059 can promote tumor tissue apoptosis.Elemene promoting nude mice gastric transplanted tumor apoptosis may be related to increased P-ERK1/2 protein and P-P38 protein，while PD98059 promoting such apoptosis may be related to increased P-P38 protein.

Nude mice；Transplanted tumor；Elemene；PD98059；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1801-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.011

2014-07-06）

浙江省卫生厅科研基金资助项目（2011KYA112）

△通信作者