刘晓阳,许和贵,费 冀
(1.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;2.贵州省中医医院,贵州 贵阳 550002)
消肿止痛散外敷治疗膝骨关节炎实验研究
刘晓阳1,许和贵2*,费 冀1
(1.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;2.贵州省中医医院,贵州 贵阳 550002)
目的:观察消肿止痛散外敷对膝骨关节炎关节软骨基质代谢的作用及对骨关节炎的防治作用。方法:建立兔膝骨关节炎模型,将造模后的兔子随机分成正常组(n=10)、模型对照组(n=10)、曲安奈德组(n=10)和消肿止痛散组(n=10),分别给予相应药物外敷治疗,测定兔膝关节外观与活动、关节液中细胞因子PGE2和IL-1β的含量及关节软骨基质中葡糖氨基聚糖的含量;同时电镜下观察关节软骨的表面光滑程度、软骨细胞排列情况、软骨基质分布、细胞核数量、滑膜细胞及滑膜下组织。结果:消肿止痛散对关节液中PGE2、IL-1β的含量均有显著降低作用,且效果优于曲安奈德;模型组GAG的含量随时间的延长而减少,曲安奈德和消肿止痛散组GAG的含量随治疗的延长而增加;通过电镜观察,消肿止痛散组软骨病变程度小,软骨的损伤程度轻。结论:消肿止痛散外敷具有抑制关节退变的作用。
消肿止痛散;膝骨关节炎;软骨基质
膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一种慢性、进行性骨关节退行性疾病。随着我国人口老龄化社会到来,其发病率呈上升趋势,流行病学调查显示,在60岁以上的人群里,50%的人有KOA的X线表现,其中45%~50%的人有KOA的临床表现[1]。KOA多发于中老年妇女,严重影响关节功能,降低生活质量,给个人、家庭和社会带来沉重负担,因此受到了广泛的重视。本研究探讨消肿止痛散对骨关节炎动物模型关节液中PGE2、IL-1β及基质中蛋白多糖含量的影响及作用机理等,为中医药防治KOA提供理论依据。
1.1 实验动物及材料
3月龄新西兰兔40只,雌雄各半,体重(2.5±0.5)kg,由贵阳医学院动物实验中心提供,生产批号GY-YX2013。木瓜蛋白酶:SIGMA公司;离心机、白介素-1β(IL-1β)放免试剂盒、前列腺素E2(PGE2)放免试剂盒由贵阳中医学院实验室提供。消肿止痛散(白芷、芒硝、三七、冰片、没药、延胡索、牛膝、刘寄奴等组成);3%戊巴比妥钠;生理盐水等。
1.2 实验方法
所有兔均在相同条件下饲养,随机将其随机分为四组:正常对照组(A)、模型对照组(B)、曲安奈德软膏外敷组(C)、消肿止痛散外敷组(D),每组各10只,按照Kitohy等[2]的方法将兔右后膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成膝骨关节炎(KOA)病变模型。正常饲养1周后将B、C、D组兔用戊巴比妥钠(30mg/kg静脉注射)麻醉生效后右后膝关节周围剃毛,然后碘伏消毒皮肤,无菌操作经关节正中进针将1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5mL注入兔膝关节,分别于实验第1、4、7日注入兔右膝关节。于末次注入木瓜蛋白酶第8天后开始给C、D组兔右后膝关节局部给药(曲安奈德或消肿止痛散白开水调敷,外敷家兔右膝关节,无菌纱布覆盖固定,每日1次,2周为1个疗程)。
实验结束后,参照Han F Ishiguro N关节液抽取方法[3]向各组兔右后膝关节腔内注入生理盐水0.8mL并反复回抽再注入3次后,抽取关节冲洗液0.5mL。经2 000r/min离心机离心15 min,取上清液置-20℃保存。按试剂盒测试要求用放射免疫方法检测关节液中PGE2、IL-1β含量。最后在无菌操作下用咬骨钳剪下各组兔右后膝取关节软骨,用内侧胫骨近端及股骨远端关节软骨提取软骨基质,用稀碱水解和蛋白酶水解超速离心法提取葡糖氨基聚糖(GAG)[4]。取外侧胫骨近端及股骨远端关节软骨置于10%甲醛溶液中固定,经甲醛固定后标本分别经5%硝酸脱钙、乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋。取蜡块作膝关节中部矢状切片,制成5~6μm切片,HE染色后于光镜下观察软骨、滑膜细胞及滑膜下组织。根据Markin骨关节病组织分类方法[5]中关节软骨与滑膜病变计分标准,对各组动物膝关节标本的病变程度进行计分和组间比较。
1.3 检测指标
①关节外观与活动:兔右后膝关节直径和关节活动度;②关节液中细胞因子测定:PGE2和IL-1β的含量;③软骨基质测定:测定关节软骨基质中葡糖氨基聚糖(GAG)的含量;④组织病理学(病理切片)检查:电镜下观察关节软骨的表面光滑程度、软骨细胞排列情况、软骨基质分布、细胞核数量、滑膜细胞及滑膜下组织。
1.4 统计学方法
2.1 兔关节外观及活动情况
造模前兔关节外观无肿胀,活动自如。造模后兔关节出现跛行,患肢不愿活动。消肿止痛散减轻关节肿胀的作用最明显,给药1周左右即有效;曲安奈德组起效较消肿止痛散组稍迟,两组的关节活动度均优于模型组。
2.2 兔膝关节液中PGE2、IL-1β含量测定
正常组关节液中两种因子含量均低,模型组显著高于正常组。消肿止痛散、曲安奈德组关节液中PGE2, IL-1β含量均有显著降低。曲安奈德降低关节液IL-1日含量的作用不及消肿止痛散,差异有统计学意义(P<0.05)。
表1 兔各组关节液中PGE2、IL-1β含量测定 (±s)
2.3 关节软骨基质中葡糖氨基聚糖(GAG)含量
消肿止痛散、曲安奈德治疗组GAG含量随治疗周期增加而增加,模型组GAG含量随时间的延长而减少;且消肿止痛散、曲安奈德组和模型对照组相比具有显著差异(P<0.05),说明两者治疗膝骨关节炎有实验室疗效。消肿止痛散、曲安奈德组在各个时期GAG含量无统计学差异(P>0.05),说明两者对膝骨关节炎的实验室治疗无明显差异。
表2 兔各组关节软骨基质GAG含量测定 (±s)
2.4 组织病理学(病理切片)检查
通过光镜下观察显示,模型组兔关节软骨细胞排列不均,表层软骨细胞欠光滑,滑膜增生及炎性细胞浸润较明显。曲安奈德组滑膜炎症较模型组轻,但软骨破坏仍明显,软骨层较正常组变薄。消肿止痛散能够在一定程度上减轻滑膜及关节腔炎症,缓解软骨破坏的作用。消肿止痛散减少软骨病理积分与滑膜病理积分的作用与模型组及曲安奈德组比较均有统计学差异。
膝骨关节炎作为骨科常见疾病之一,属于中医学“痹症”范畴,主要的中医病理特点为本虚标实,主要病因病机为肝肾亏虚、邪瘀痹阻,治疗以扶正祛邪为治则。消肿止痛散方药由白芷、芒硝、三七、冰片各9g,没药、牛膝各6g组成,诸药合用,共奏祛风除湿、活血排脓、生肌止痛之功效。
现代药理学研究表明消肿止痛散其主要成分白芷具有明显的镇痛作用,其镇痛机理可能依赖于脑内单胺类神经递质[6];此外,白芷主要成分香豆素类化合物有显著扩张血管、改善血液循环的作用[7]。方中芒硝性咸、苦、寒,具有清热、散瘀、软坚、消肿的作用,其主要成分为硫酸钠,通过水溶液中钠盐与硫酸盐的各种特殊反应,使周围血管舒张,增加吸收、减少渗出,并通过神经反射达到消肿止痛的效果[8]。三七味甘、微苦、性温,其功效定痛,三七的主要活性成分为三七总皂苷,对急性炎症引起的毛细血管通透性升高、炎性渗出和组织水肿以及炎症后期肉芽组织增生有明显的抑制作用[9]。冰片可抑制炎症因子白介素-1、肿瘤坏死因子及细胞黏附分子-1的表达并改善上皮细胞的细胞膜磷脂分子排列,从而达到抗菌镇痛的作用[10]。没药挥发油具有较强的镇痛作用,并呈一定的剂量依赖趋势。牛膝所含蜕皮甾酮具有较强的蛋白质合成促进作用。其以散剂的方式直接接触创面,浓度高、起效快,使用麻油和蜂蜡作为溶剂,性质柔和,对皮肤刺激性小,渗透作用强。
本实验证实了应用消肿止痛散治疗早中期膝骨关节炎,局部PGE2和IL-1β的含量明显减少,同时关节软骨基质中葡糖氨基聚糖(GAG)的含量显著增加,从而达到缓解骨关节炎患者关节疼痛、消除关节肿胀、恢复关节功能、改善膝关节炎软骨的退变作用。
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(责任编辑:魏 晓)
2014-07-01
贵阳中医学院科研项目(贵中医科院内【2013】35号)
刘晓阳(1986-),男,贵阳中医学院硕士研究生,研究方向为骨与关节损伤。
许和贵(1982-),男,贵州省中医医院主治医生,研究方向为中西医结合治疗骨伤科疾病。E-mail:xhg198212@163.com
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A
1673-2197(2014)23-0008-02