羟基喜树碱的代谢与CYP450的相关性研究

胡巍，胡文晋，方芸*

1南京大学医学院附属鼓楼医院，南京　210008；2南京市第二医院，南京　210003

羟基喜树碱的代谢与CYP450的相关性研究

胡巍1，胡文晋2，方芸1*

1南京大学医学院附属鼓楼医院，南京210008；2南京市第二医院，南京210003

摘要目的：研究羟基喜树碱（HCPT）在体外小鼠肝微粒体中对CYP450活性的影响，为临床合理联合用药提供参考。方法：在小鼠体外肝微粒体中分别加入六种亚型酶的探针药物对乙酰氨基酚、非那西丁、双氯芬酸钠、睾酮、酒石酸美托洛尔、奥美拉唑和羟基喜树碱溶液，在优化的孵育体系下温孵。用HPLC法测定各空白对照组和羟基喜树碱溶液中各探针药物代谢产物的浓度并比较代谢率的差异，以评价羟基喜树碱对各亚型酶活性的影响。结果：在代谢反应过程中，在50～200 μmol·L-1内，羟基喜树碱的浓度与孵育体系中CYP3A4的特异性底物睾酮、CYP2E1的特异性底物对乙酰氨基酚的剩余药量呈正比例关系，且具显著性差异（P＜0.05），与其他四种探针药物的剩余药量无明显的浓度依存关系（P＞0.05）。结论：HCPT在肝微粒体的代谢反应过程中受代谢酶CYP3A4和CYP2E1的作用，竞争性地抑制了睾酮和对乙酰氨基酚在肝微粒体中的代谢。

关键词羟基喜树碱；CYP450酶；探针药物；肝微粒体法

药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程被称为药物代谢（drug metabolism）。绝大多数药物代谢均是在细胞内特异的酶催化反应。肝细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）是一种结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，是肝微粒体混合功能氧化酶系的主要成分，参与许多药物在体内的Ⅰ相代谢过程，是药理学、毒理学研究热点，尤其对阐明药物间的相互作用，指导临床合理用药有重要意义[1]。因此欧美各国已经把对CYP450酶的测定用于新药的筛选及代谢研究，并把它列为新药申报必须进行的一项试验[2]。羟基喜树碱（hydroxycamptothecin，HCPT）是从中国特有的珙桐科植物喜树中分离出的一种吲哚类生物碱，具有较强抗肿瘤活性，临床上可用于多种癌症的治疗。前期实验中雾化吸入HCPT治疗小鼠肺癌的药效学表明，雾化给药比腹腔和静脉注射有较为明显的抗肿瘤作用，但是关于雾化吸入HCPT治疗肺癌的临床前药代动力学、排泄、代谢研究较少。目前，关于羟基喜树碱在肝匀浆中的代谢以及CYP450酶对羟基喜树碱代谢的影响国内外尚未见报道。本实验通过CYP450酶与羟基喜树碱代谢的相关性研究，旨在探讨羟基喜树碱在肝匀浆中的代谢以及对参与其代谢的CYP450酶活性的影响，为临床安全联合用药提供理论依据。

1　材料

1.1试剂与药品

HCPT注射液原料药及标准品（黄石李时珍药业集团武汉李时珍药业有限公司，批号：20090701）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；其它试剂均为分析纯。

NADPH购于BD公司；对乙酰氨基酚（中国食品药品检定研究院，100018-200408）；非那西丁（中国食品药品检定研究院，100095-200204）；睾酮（上海源叶生物科技有限公司，YY91628）；双氯芬酸钠（中国食品药品检定研究院，100334-200302）；酒石酸美托洛尔（中国食品药品检定研究院，100084-201102）；奥美拉唑（中国食品药品检定研究院，100367-201003）；鼠肝微粒体购于BD公司。

1.2仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪；SPD-10A型荧光检测器（美国Agilent公司）；吹气式浓缩干燥器（汉邦科技有限公司）；5417R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；Direct-Q超纯水器（Millipore公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3主要试剂的配制

羟基喜树碱（HCPT）对照品溶液的配制：精密称取HCPT对照品5.0 mg置于100 mL的棕色量瓶中，以二甲亚砜（DMSO）溶解并定容至刻度，得浓度为50.00 μg·mL-1HCPT标准储备液。取该标准储备液10 mL，分别以pH=3的溶液稀释成浓度为25.00 μg·mL-1的L-HCPT标准液和pH=10的溶液稀释成C-HCPT标准液，备用。

酒石酸美托洛尔、双氯芬酸钠、非那西丁、对乙酰氨基酚、奥美拉唑对照品溶液的配制：精密称定上述各药物对照品适量，分别置于量瓶中，加蒸馏水超声溶解，定容，摇匀得质量浓度为0.685、0.391、0.406、0.152、0.345 mg·mL-1的标准品溶液，4℃放置备用。

睾酮对照品溶液的配制：精密称定睾酮对照品适量，置于量瓶中，加乙腈超声溶解，定容，摇匀得质量浓度为0.288 mg·mL-1的标准品溶液，4℃放置备用。

2　方法

2.1样品的分析

2.1.1孵育体系中探针药物的测定色谱柱：Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），C18预柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：25℃。

酒石酸美托洛尔的流动相乙腈-醋酸铵缓冲液（3.9 g醋酸铵，加水至810 mL，加三乙胺2.0 mL，加冰醋酸10 mL，加磷酸3.0 mL）为25∶75，检测波长275 nm。

睾酮的流动相水-乙腈为50∶50，检测波长245 nm。

双氯芬酸钠的流动相甲醇-0.2%磷酸水溶液为80∶20，检测波长276 nm。

非那西丁的流动相乙腈-0.2%磷酸水溶液为30∶70，检测波长275 nm。

对乙酰氨基酚的流动相乙腈-0.2%磷酸水溶液为15∶85，检测波长249 nm。

奥美拉唑的流动相甲醇-水（0.3%三乙胺、0.12%磷酸）为67∶33，检测波长302 nm。

精密吸取探针对照品储备液，以适量孵育液将其分别稀释适量浓度，以质量浓度（C，μg·mL-1）对峰面积（A）进行线性回归，求得标准曲线方程。用空白孵育液配制低、中、高3种浓度的探针溶液，分别进样，测定峰面积，将测得的探针药物的峰面积带入标准曲线方程，计算相应浓度，考察探针药物的回收率。

2.1.2孵育体系中羟基喜树碱的测定色谱柱：Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），C18预柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.075 mol·L-1醋酸盐缓冲液（pH 6.4）=34∶66（含0.2%的三乙胺）；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：25℃；荧光检测器Ex：363 nm，Em：550 nm。在上述色谱条件下，将空白、含药孵育液分别进样，考察其方法学的专属性。精密吸取羟基喜树碱对照品溶液，以适量孵育液将其分别稀释至适当浓度，以质量浓度（C，μmol·L-1）对峰面积（A）进行线性回归，求得标准曲线方程。用空白孵育液配制低、中、高3种浓度的羟基喜树碱溶液，分别进样，测定峰面积，将测得的羟基喜树碱的峰面积带入标准曲线方程，计算相应浓度，考察羟基喜树碱的回收率。

2.2体外肝微粒体实验

2.2.1肝微粒体反应孵育体系孵育体系总体积200 μL，反应体系中包含NADPH（1 mmol·L-1）、微粒体蛋白（1 mg·ml-1）、氯化镁溶液（5 mmol·L-1）、磷酸盐缓冲液（0.1 M）。羟基喜树碱及各种底物用不同比例的溶剂配制，反应体系中甲醇终体积分数小于0.5%。反应在37℃水浴中进行，预孵育5 min，加入NADPH启动反应，30 min后，加入125 μL冰甲醇，终止反应。涡旋1 min后，13000 r·min-1离心10 min，取上清液若干进行分析。

2.2.2肝微粒体孵育条件的优化在含有不同的蛋白浓度（0.1、0.5、1.0、1.3 mg·mL-1）的肝微粒体酶中加入羟基喜树碱（100 μmol·L-1），在37℃水浴中孵育（0.25、0.5、0.75、1 h）。考察肝微粒体孵育体系中，不同孵育时间、肝微粒体不同蛋白浓度对羟基喜树碱代谢的影响。

2.2.3羟基喜树碱在肝微粒体中的代谢动力学参数在蛋白浓度为1 mg·mL-1的肝微粒体孵育体系中，分别加入不同量的羟基喜树碱（终浓度为40、50、80、100、150、200 μmol·L-1），37℃水浴中孵育30 min。根据Lineweaver-Burk双倒数曲线，求得米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），其截距的倒数即为Vmax值，斜率与Vmax的乘积即为Km值，Vmax/Km即为CLint(体外酶对药物的清除率)，从而得出羟基喜树碱在肝微粒体代谢过程中的代谢动力学参数。

2.2.4羟基喜树碱对不同探针药物代谢的影响

在蛋白浓度为1 mg·mL-1的肝微粒体孵育体系中，各CYP450代谢酶亚型的探针药物的终浓度为100μmol·L-1，加入不同浓度的羟基喜树碱（终浓度为50、100、200 μmol·L-1），考察不同浓度的羟基喜树碱对各CYP450代谢酶亚型的探针药物的影响。

3　结果

3.1样品的测定

3.1.1孵育体系中探针药物的测定空白孵育液对探针药物的测定没有干扰，探针药物的标准曲线、平均回收率、精密度见表1，HPLC方法适合孵育体系中探针药物的测定。

表1　探针药物标准曲线

3.1.2孵育体系中羟基喜树碱的测定空白孵育液对羟基喜树碱的测定没有干扰，羟基喜树碱标准曲线方程：A=0.09071C＋0.195697，A为峰面积，C为羟基喜树碱浓度（μmol·L-1），羟基喜树碱在2.5～200 μmol·L-1线性关系良好。平均回收率为92.89%，RSD为2.81%。

3.2体外肝微粒体实验

3.2.1孵育条件的优化在含有不同的蛋白浓度（0.1～1.2 mg·mL-1）的肝微粒体酶中加入羟基喜树碱100 μmol·L-1，分别在37℃水浴中孵育15、30、45、60 min。不同孵育时间、不同肝微粒体蛋白浓度对羟基喜树碱代谢的影响见图1，由图1可知在肝微粒体的孵育体系中，当肝微粒体蛋白含量为1 mg·mL-1、孵育时间为30 min时，羟基喜树碱的代谢反应速率最大，并达到稳态。

图1　肝微粒体孵育条件的优化

3.2.2羟基喜树碱在肝微粒体中的代谢动力学参数羟基喜树碱在肝微粒体孵育体系中的代谢动力学参数见表2，反应曲线见图2。

表2　羟基喜树碱在肝微粒体中反应的代谢动力学参数

3.2.3不同浓度的羟基喜树碱对不同探针药物代谢的影响不同浓度的羟基喜树碱对不同探针药物代谢的影响见图3。

图2　C-HPLC及L-HCPT在肝微粒体代谢酶促反应速率曲线

由图3可知，在代谢反应过程中，在50～200 μmol·L-1内，羟基喜树碱的浓度与孵育体系中CYP3A4的特异性底物睾酮、CYP2E1的特异性底物对乙酰氨基酚的剩余药量呈正比例关系，且具显著性差异（P＜0.05），与孵育体系的CYP2D6的特异底物酒石酸美托洛尔、CYP1A2的特异底物非那西丁、CYP2C9特异性底物双氯芬酸钠、CYP2C19的特异性底物奥美拉唑的剩余药量无明显的浓度依存关系（P＞0.05）。

推测羟基喜树碱在肝微粒体代谢反应过程中受CYP3A4和CYP2E1的作用，竞争性抑制了CYP3A4和CYP2E1对睾酮和对乙酰氨基酚在肝微粒体中的代谢。

图3　不同浓度的羟基喜树碱对探针药物代谢的影响

4　讨论

肝微粒体体外温孵试验是应用较为普遍的药酶代谢体外研究方法，且被美国相关指导原则所推荐。由于肝微粒体中的代谢酶多种多样，本实验选用了特异性高、选择性好且广泛被应用的的探针底物对乙酰氨基酚、非那西丁、双氯芬酸钠、睾酮、酒石酸美托洛尔和奥美拉唑分别作为CYP2E1、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、CYP2D6和CYP2C19亚型酶的探针药物。

本实验对肝微粒体孵育体系进行了优化，确定了孵育体系的条件：孵育时间为30 min，肝微粒体蛋白含量为1 mg·mL-1。C-HCPT在肝微粒体中反应的代谢动力学参数：Vmax=0.0235 μmol·mg-1·min-1，Km=1353.6643 μmol·L-1，Clint=0.017 mL·mg-1·min-1。L-HCPT在肝微粒体中反应的代谢动力学参数：Vmax=0.02479 μmol·mg-1·min-1，Km=1152.0666 μmol· L-1，Clint=0.022 mL·mg-1·min-1。说明肝微粒体中酶对L-HCPT的亲和力较好，且L-HCPT的反应速率快，因此选择L-HCPT作为反应底物。睾酮是CYP3A4的特异性底物；酒石酸美托洛尔是CYP2D6的特异性底物；对乙酰氨基酚是CYP2E1的特异性底物，非那西丁是CYP1A2的特异性底物；奥美拉唑是CYP2C19的特异性底物。研究结果表明，羟基喜树碱的浓度在50～200 μmol·L-1内对孵育体系中睾酮、对乙酰氨基酚的代谢有抑制作用，且呈现剂量依赖型影响，对酒石酸美托洛尔、非那西丁、双氯芬酸钠、奥美拉唑的剩余药量无显著性影响。推测羟基喜树碱在肝微粒体代谢反应过程中受代谢酶CYP3A4和CYP2E1的作用，竞争性地抑制了睾酮和对乙酰氨基酚在肝微粒体中的代谢。在今后的实验中，将进一步研究有关代谢物的结构、药理活性等，为临床HCPT与其他药物的联合使用提供选择依据。

参考文献

[1] Zimmerman HJ.Drug-induced liver disease[J].Clin Liver Dis,2000,4:73-96.

[2] 樊慧蓉，和凡，刘昌孝.CocktaiL探针药物法用于评价细胞色素P450同工酶影响的研究进展[J].中国药学杂志，2006，41（14）：1045-8.

中图分类号R965；R979.1

文献标志码A

文章编号1673-7806（2014）05-412-04

作者简介胡巍，女，主管药师E-mail:huwei-82@163.com

*通讯作者方芸，硕士生导师E-mail:njglfy@163.com

收稿日期2014-04-23修回日期2014-07-03

Correlation between Hydroxycamptothecin Metabolism and CYP450 Activity

HU Wei1,HU Wen-jin2,FANG Yun1*
1The Affiliated DrumTower Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008;2The Second Hospital of Nanjing,Nanjing 210003

ABSTRACTObjective：To investigate the effect of hydroxycamptothecin（HCPT）on CYP450 in rat liver microsomes in vitro,providing reference for clinical rational use of drug combination therapy.Methods：Probe drugs of testosterone,tartrate,phenacetin,diclofenac sodium,acetaminophen,and omeprazole as well as HCPT were added to incubation systems of rat liver microsomes in vitro,the concentrations of the probe drugs in blank or with HCPT were determined by HPLC after incubation and the differences of metabolic rates were compared to evaluate the effects of HCPT on the activities of the six CYP450 subtypes.Results：L-HCPT at 50～200 μmol·L-1inhibited the metabolismof testosterone and acetaminophen and had no effect on the metabolismof metoprolol tartrate,phenacetin,diclofenac sodiumand omeprazole.Conclusion：We concluded that HCPT is affected by CYP3A4 and CYP2E1 in the metabolic process and competitively inhibited the metabolismof testosterone and acetaminophen in liver microsomes.

KEY WORDHCPT;CYP450;Probe drug;Liver microsomes method