多指标正交试验优选连芩软膏的提取工艺

刘坚初 ，林 丽 ，强 姣 ，童国勇

（1.广东省中山市黄圃人民医院，广东 中山 528429； 2.广州中医药大学，广东 广州 510006）

连芩软膏是黄圃人民医院与广州中医药大学新药开发研究中心共同开发的新制剂，具有清热解毒、消肿止痛、敛疮生肌的功效，临床主要用于各型痤疮及痤疮感染。组方中君药黄连临床用于痈肿疮毒及皮肤湿疮，也可制膏外用，常与黄芩、黄柏等配伍，现代药理研究表明其具有抗菌、抗炎、镇痛等作用，有效成分为盐酸小檗碱[1-2]。盐酸小檗碱易溶于乙醇[3]，为避免其在黄连煎煮、浓缩过程中的损失，大生产多采用渗漉法作为黄连中盐酸小檗碱的最佳提取方式[4]。2010年版《中国药典（一部）》收载的黄连成方制剂多采用醇提工艺，如隆清片、香附片、左金胶囊等。另外，臣药黄芩的乙醇提取物也具有抗菌、抗炎、解热镇痛等作用[5]。为此，本研究中采用正交试验法优选了连芩软膏的乙醇渗漉提取工艺参数，旨在为制剂的研究开发奠定基础。

1 仪器与试药

岛津LC-20A型高效液相色谱仪，包括ΜV检测器、LC-20AT泵、SIL-20A自动进样器、Labsolution色谱工作站；CP225D型万分之一分析天平（Mettler Toledo）；AB2004-N型十万分之一分析天平（Mettler Toledo）。黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110715-201016）；盐酸小檗碱对照品（上海融禾医药科技有限公司，批号为110322）；色谱甲醇购自Merck公司，水为自制超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷及盐酸小檗碱的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Kromasil C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）；流动相:甲醇（A）-0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～20 min 时 40%A，20～30 min时 40% ～50%A，30～40 min时50%A，40～45 min时 55% ～40%A，45～50 min时 40%A；流速:1.0 mL /min；检测波长:黄芩苷280 nm，盐酸小檗碱345 nm；柱温:30℃；进样量:10μL。在此色谱条件下，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上有相同保留时间的色谱峰，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

称取黄芩苷对照品 2.44 mg、盐酸小檗碱对照品4.94 mg，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品贮备液；精密量取黄芩苷贮备液和盐酸小檗碱贮备液各1.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（含黄芩苷 0.0244 g/L、盐酸小檗碱 0.049 g /L）。按处方比例称取全方药材，粉碎成粗粉，装入渗漉装置，少量70%乙醇浸润24 h后，用10倍量的70%乙醇进行渗漉，渗漉速率为6mL/（min·kg），收集渗漉液，置500 mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品原液；精密量取供试品原液1.0 mL，置10mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按处方比例称取除黄芩外的全方药材，或除黄连、黄柏和黄藤外的全方药材，分别按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 标准曲线绘制

按2.1.1项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液0，2，4，8，12，16，20 μL，注入色谱仪测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y）、对照品进样质量（μg）为横坐标（X）绘制标准曲线，回归方程黄芩苷为 Y＝3 323 939.496 5X+1 558.846 4（r＝ 1.000 0）；盐酸小檗碱为 Y＝3 563 917.535 7X-3 261.402 7（r＝1.000 0）。结果表明，黄芩苷与盐酸小檗碱的进样质量分别在0.204 8～2.048 0μg和 0.216 0～2.160μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。另外，本研究中所建立的含量测定方法已于前期进行了方法学考察，结果表明，该方法合理、可行。

2.2 浸膏得率的测定

精密量取供试品原液100mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥至恒重，精密称定，计算浸膏得率。

2.3 正交试验

正交试验设计:在确定乙醇渗漉工艺路线基础上，根据预试验结果，选取乙醇浓度（因素A）、溶剂用量（因素 B）、药材粉碎粒度（因素 C）及渗漉速率（因素D）为考察因素，因素水平见表1。

表1 因素水平表

正交优选试验:按照正交试验设计进行试验，提取效果以君药黄连、臣药黄芩中有效成分盐酸小檗碱、黄芩苷的提取率(指标Ⅰ，指标Ⅱ)和组方的浸膏得率(指标Ⅲ)为指标，提取率（%）＝黄芩苷得率/药材中黄芩苷含量×100%。并按照盐酸小檗碱0.42、黄芩苷0.18、浸膏得率0.4的权重系数对其进行加权评分，分别填于正交设计软件，进行直观分析。方差分析，结果见表2及表3。

表2 L9（34）正交试验结果

表3 方差分析结果

结果分析:由表2中 R值可知，乙醇浓度、粉碎粒度是影响渗漉工艺提取效果的主要因素，溶剂用量、渗漉速率次之。方差分析（表3）结果显示，因素A及C对渗漉工艺中盐酸小檗碱、黄芩苷的提取率和浸膏得率的影响有显著性。结合极差分析结果及低耗高效原则，确定连芩软膏最佳渗漉工艺条件为A2B3C2D3，即处方药材粉碎成粗粉，加12倍量70%乙醇进行渗漉，渗漉速率为 9 mL /（min·kg）。

2.4 工艺验证试验

按最佳渗漉工艺条件A2B3C2D3进行重复试验，结果见表4。可见，该工艺合理，稳定可行。

3 讨论

盐酸小檗碱及黄芩苷的抗炎、抗菌药效作用提示，本制剂渗漉工艺正交试验选取君药黄连中盐酸小檗碱及臣药中黄芩苷的提取率作为考察指标之一，具有合理性。另外，本试验过程中发现，组方中除去君药黄连外，黄柏、黄藤同样含有盐酸小檗碱（以盐酸小檗碱计，黄连中含量为6.08%，黄柏中含量为3.55%，黄藤中含量为2.54%）。为避免试验差错，故制备了缺黄连、黄柏、黄藤的阴性样品考察盐酸小檗碱的专属性，同时将黄柏、黄藤药材也作为综合评分的权重系数之一。因此，本试验中给予盐酸小檗碱及黄芩苷权重系数分别为0.42和0.18，以及浸膏得率的权重系数为0.4，进行综合评分。若能加之药理试验，对正交试验进行评价，则所优选工艺更显合理性。

表4 最佳工艺条件验证试验

参考文献:

[1]余园媛，王伯初，彭 亮，等.黄连的药理研究进展[J].重庆大学学报，2006，29（2）:107-108.

[2]李 娜，陈琴华.黄连-小檗碱的药理作用研究概况[J].中国临床医药研究杂志，2006（159）:28-29.

[3]罗音久，曾中良，古淑英，等.黄连须中盐酸小檗碱的提取工艺研究[J].四川畜牧兽医学院学报，2002，16（3）:17-18.

[4]芩志芳，郭淑英.用正交设计法优化黄连的提取工艺研究[J].中国民族民间医药，2009(12):17-18.

[5]刘菊福，卢长安，廖福龙，等.不同产地黄芩提取物主要药效作用的比较[J].中国中医药信息杂志，2001，8（3）:28.