达比加群酯中空微球的制备及溶剂选择

刘元芬,丁亚飞,郑春丽

（1.江苏建康职业学院,江苏 南京 210029； 2.中国药科大学药物制剂研究所,江苏 南京 210009）

达比加群酯为新合成的直接凝血酶抑制剂,为dabigatran的前体药物,属非肽类的凝血酶抑制剂[1]。本研究中采用乳化蒸发法制备达比加群酯中空微球,以期使制剂在胃液中长时间漂浮,延长释药时间,使药物缓慢到达肠道,促进药物在胃肠道的吸收。同时,主要对达比加群酯中空微球的制剂学基本性质进行了研究,现报道如下。

1 仪器与试药

RW 20型电动搅拌器（德国IKA公司）；Agilent1100型HPLC（美国Agilent公司）；ZRS-8G型智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；S-3400N型扫描电镜（日本Hitachi公司）。达比加群酯（上海灏云化工科技有限公司,纯度大于99.0%,批号为13041527）；乙基纤维素（上海卡乐康包衣技术有限公司,10CP）；聚乙烯醇（PVA124,国药集团化学试剂有限公司,进口分装）；司盘80、二氯甲烷、无水乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 中空微球形成机理

在1991年Kawashima等[2]首次报道了中空微球给药系统的制备,并步构思了中空微球的形成机理。中空微球的形成主要依靠有机溶剂二氯甲烷和乙醇。当骨架材料溶解在二氯甲烷和乙醇组成的混合溶剂中,加入到水溶液后则形成O/W的乳滴。由于乙醇为亲水性有机溶剂,会快速扩散到水溶液中,同时使骨架材料析出、表面固化；而二氯甲烷为疏水性有机溶剂,则停留在微球的中心,随着搅拌时间的延长,二氯甲烷则缓慢挥发而形成空腔[3]。

2.2 混合溶剂比例筛选

根据中空微球形成的机理设计验证试验。选择乙醇与二氯甲烷之比为 10∶0,9∶1,5∶5,1∶9,0∶10 共 5 个比例来制备空白中空微球。将乙基纤维素0.6 g加入到无水乙醇与二氯甲烷的混合溶剂中,搅拌混匀后,缓慢滴加至含有吐温80的聚乙烯醇溶液中,至有机溶剂挥发完全,物质形态见图1。

图1 乙醇与二氯甲烷不同比例制备的物质形态

可见,当主要用乙醇溶剂来制备中空微球时,由于乙醇为亲水性溶剂,扩散到水溶液中,乙基纤维素会在水溶液中析出而变成絮状沉淀。当主要用二氯甲烷来制备中空微球时,由于二氯甲烷为疏水性溶剂,扩散性差,可导致微球最后变成实心颗粒状；当混合有机溶剂乙醇与二氯甲烷之比为5∶5时,亲水溶剂乙醇先扩散至水溶液中,使表面骨架材料成圆形析出,然后疏水性溶剂二氯甲烷缓慢析出而形成空腔,所制备的中空微球具有非常明显的空腔,球形较好。因此,亲水溶剂和疏水溶剂的混合加入对于中空微球的形成至关重要。

2.3 达比加群酯中空微球制备

采用乳化蒸发法制备[3-4]。将乙基纤维素0.6 g与达比加群酯0.12 g（5∶1）加入到无水乙醇与二氯甲烷的混合溶剂（3mL∶3mL）中,搅拌混匀,然后缓慢滴加至含有 0.45%（g/mL）吐温 80的30mL（1.5%）聚乙烯醇溶液中,以 210 r/min 转速搅拌 2 h,至有机溶剂完全挥发,过80目筛收集,蒸馏水迅速荡洗,真空干燥器中干燥24 h,干燥后筛选16～40 目（500～1000μm）粒径的微球,备用[5]。

2.4 药物含量测定建立

2.4.1 色谱条件[6]

色谱柱:Agilent C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm)；流动相:0.2%的醋酸铵溶液（用冰醋酸调节 PH 至 4.4）-乙腈（50∶50）；检测器:紫外检测器；检测波长:226 nm；柱温:室温；进样量:20μL。

2.4.2 方法学考察

标准曲线绘制:精密吸取质量浓度分别为 10,20,40,60,80,100μg/mL的达比加群酯溶液 20μL,依法进样。200～800 nm 紫外全波长扫描见图2,可见,达比加群酯在乙腈溶剂中的最大吸收波长为226 nm,且空白微球在此波长处不干扰测定。在检测波长226 nm下所得色谱图见图3。按拟订的色谱条件测定峰面积,以对照品进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程 A=38.58C ＋4.123,r2=0.9999（n=6）。

精密度试验:精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL,重复进样5次,按拟订的色谱条件进样测定。结果对照品溶液和供试品溶液平均峰面积积分值的 RSD分别为1.52%和1.69%（n=5）。

回收率试验:称取空白微球10 mg,乙腈溶解,流动相定容于10 mL容量瓶中,精密吸取对照品溶液1mL置10mL容量瓶中,加空白微球溶液定容至刻度,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,取20μL依法进样测定。结果平均回收率为98.70%,RSD=1.83%。

2.4.3 含量测定

精密称取制备的中空微球10 mg,置10 mL容量瓶中,甲醇溶解,摇匀,甲醇定容至刻度；移取 0.5 mL溶液,置10 mL容量瓶中,甲醇稀释,摇匀,定容至刻度。采用高效液相色谱法测定并计算中空微球中达比加群酯的百分含量（mg/mg）。结果的药物的百分含量为（11.18±0.05）% （n=3）。

2.5 主要制剂学性质考察

微球外观形态观察:取制得的粒径为500～1000μm的空白中空微球、含药中空微球,排列好后置铜片上喷金（15～20 nm）,置S-3400N型扫描电子显微镜以相同放大倍数观察2种微球粒子的微观形态,加速电压设定为20 kV,结果见图4。可见,空白中空微球表面较光滑,球形度较好,具有明显的空腔,局部放大可见微小细孔；达比加群酯中空微球的表面附有较多颗粒状物质,与空白中空微球（不含药）对照,可以确定表面附着的物质为药物；在中空微球球壁能看到许多细小空隙,应为气体逃逸时所产生。中空结构的存在可使微球的密度低于胃液的密度,从而产生胃漂浮性能。

图2 紫外全波长扫描图

图3 高效液相色谱图

体外漂浮性能测定:取制得的微球100粒,置溶出度测定仪中进行漂浮性能测试,介质为人工胃液（pH=1.2）水溶液150mL。在温度37℃、转速50 r/min下搅拌,10 h后收集微球的漂浮部分和非漂浮部分。漂浮微球的漂浮力可通过公式计算[7]。P（%）=Sf÷100×100%。式中 F为漂浮百分率,Sf为10 h后漂浮微球的个数。经计算,10 h 后中空微球的漂浮百分率为（86.33 ±0.03）%（n=3）,表明在较长时间里达比加群酯中空微球的体外漂浮性能良好。

体外释放度测定:按照2010年版《中国药典（二部）》测定法中转篮法测定。取粒径为500～1000μm的中空微球适量（约含达比加群酯 22 mg）,置溶出度测定仪中,转速为 100 r/min,以pH =1.2的人工胃液 900 mL 为释放介质,温度为（37±0.5）℃,于 0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,24.0 h 时取样5 mL,同时添加补液[8]。样品溶液经 0.8μm微孔滤膜滤过,人工胃液稀释后,于325 nm波长处测定吸光度（避免紫外测定中末端吸收）,紫外分光光度法计算（标准曲线为 A=0.043＋0.0201C,r2=0.998,线性范围为 4～16 μg/mL）,以释药时间为横坐标、累积释药百分率为纵坐标绘制体外释药曲线,结果见图5。

图4 中空微球的扫描电镜图

图5 载药微球累积释药曲线（n=3）

3 讨论

达比加群酯口服经胃肠吸收后,在体内转化为具有直接抗凝血活性的dabigatran。dabigatran结合于凝血酶的纤维蛋白特异结合位点,阻止纤维蛋白原裂解为纤维蛋白,从而阻断了凝血瀑布网络的最后步骤及血栓形成；还可从纤维蛋白-凝血酶结合体上解离,发挥可逆的抗凝作用。达比加群酯于2008年4月首次在德国和英国上市,2010年10月20日美国食品药物管理局（FDA）批准其应用于非瓣膜性心房颤动患者脑卒中及全身血栓栓塞的预防,是继华法林之后50年来上市的首个新类别口服抗凝血药物[9]。与华法林相比,达比加群酯具有可口服、强效、无需特殊用药监测、药物相互作用少等优点[10]。针对深静脉血栓的治疗及一级预防,达比加群酯只需每日1次,大大增加了患者的依从性；但针对非瓣膜性心房颤动患者脑卒中及全身血栓栓塞的预防,则需2次/d[11],给药至少3个月、6个月或12个月[12],降低了患者的顺应性。因此,根据达比加群酯的性质,有必要研究开发适合其每日一次、可长期给药的剂型,用以预防全身性血栓性疾病。

中空微球是一种带有较大空腔的固体微球制剂,中空微球给药系统被认为是胃漂浮给药系统中最有前景的形式。由于中空微球可长时间漂浮在胃内,能够用于治疗局部胃部疾病或者延长药物作用时间[13]。近年来,许多研究者对这种新制剂形式进行了研究和报道。Kawashima等[2]1991年首先报道了胃漂浮载药中空微球的制备,主要制备方法为,首先采用乳化蒸发方法制备含有有机溶剂（乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙醚）的乳剂,然后蒸发有机溶剂,形成中空的微球。

达比加群酯为脂溶性药物,在 PH =1.2的酸性环境溶解度最大,因此本试验中制备的中空微球是可行的。利用中空微球可长时间漂浮在酸性胃液中的性质,可增加达比加群酯在胃中的溶解度,使药物缓慢到达肠道而被吸收,从而提高药物的生物利用度。在制备中空微球的过程中,将乙醇和二氯甲烷组成的混合溶剂加入到含吐温80的聚乙烯醇溶液中,混合溶剂相当于油相,在聚乙烯醇溶液中乳化形成乳滴；后来由于溶剂的挥发,乙基纤维素和药物析出,形成中空微球。该法制备的中空微球性质较稳定,方法简单易行；中空微球在体外能长时间漂浮在液面,漂浮性能良好。但处方中应用了毒性较大的有机溶剂二氯甲烷,如何筛选更加安全的有机溶剂需要进一步研究。体外释放行为考察结果表明,达比加群酯中空微球在pH=1.2的盐酸溶液（释放介质）中的释放行为符合缓释制剂的要求。

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