高效液相色谱法测定5-氟尿嘧啶复乳原位凝胶的含量

王璐璐,陈少华,相 莉,张秀立,郑稳生

（中国医学科学院药物研究所·药物传输技术及新型制剂北京市重点试验室,北京 100050）

5-氟尿嘧啶（5-FU）是治疗大肠癌的基本用药,通过抑制胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶,阻碍DNA合成,达到抗肿瘤的作用,现有给药方式为注射及口服。口服给药产生的骨髓抑制作用较静脉注射持久,静脉注射和静脉滴注的给药途径较好,但注射部位易发生静脉炎,少数患者发生神经系统和心脏毒性以及维生素B1缺乏症,长期动脉插管给药又会引起动脉血栓[1]。动物实验表明,5-FU栓剂比口服给药治疗直肠癌更有效[2-4],但传统的栓剂药物吸收差,对黏膜的刺激性大,药物停留时间短,患者顺应性低,故对氟尿嘧啶的剂型进行了大量探索[5]。本研究中应用原位凝胶技术结合复乳化技术制备了5-FU复乳原位凝胶,旨在提高药物经黏膜吸收的效率且减少药物对黏膜的刺激性。笔者采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定该制剂的含量,结果灵敏、准确、可靠。现报道如下。

1 仪器与试药

HP8453型紫外分光光度计（美国惠普公司）；Agilent1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；HPLCWaters 2487检测器Waters 515泵；FA1004N型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。5-氟尿嘧啶（上海诺泰化工有限公司,含量99.3%）；Poloxamer系列为BASF公司赠送；海藻酸钠（河北大唐生物工程有限公司）；1.2-丙二醇,Tween 80,Span 80（西陇化工股份有限公司）；5-FU复乳原位凝胶（中国医学科学院药物研究所,规格为 200 g/L,批号分别为 20130515,20130516,20130517）；5-FU对照品 （中国药品生物制品检定所,批号为200602,含量为99.2% ）；Poloxamer 407（BASF 公司赠送）；甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.15-FU复乳原位凝胶的制备[6-10]

5-FU 复乳:将大豆油、Span 80、Tween 80和 1.2-丙二醇按22∶5∶1∶6的比例混合,在 45℃、转速为 2000 r/min的条件下持续搅拌,逐滴加入1.5%的5-FU水溶液33mL,继续搅拌10min,得到白色微乳。取15 mL 6%Poloxamer水溶液,在 4℃,转速为700 r/min的条件下持续搅拌,逐滴加入第一步制得的5-FU微乳15mL,继续搅拌10min,得白色复乳。

5-FU复乳原位凝胶:取含有适量Poloxamer 407和海藻酸钠的水溶液,在4℃和转速为700 r/min的条件下持续搅拌,与一定量5-FU复乳混合,继续搅拌10 min,缓慢升温至室温,得到白色凝胶。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

参考文献[11],用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Hypersic-C18柱(150 mm ×4.6mm,5 μm)；流动相:水（用 0.05 mol/L磷酸溶液调节 PH 至 3.5）-甲醇（95∶5）；检测波长:266 nm；流速:1mL/min。取对照品溶液、样品溶液及空白溶液,紫外检测器在200～400 nm波长范围内进行扫描,5-FU在266 nm波长下有最大吸收,故选择266 nm作为测定波长。取供试品及对照品溶液20μL,按拟订色谱条件注入高效液相色谱仪,理论板数按5-FU峰计算应不低于5000,在此色谱条件下的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3 溶液制备

取5-FU复乳原位凝胶1mL,加流动相稀释至含5-FU10μg/mL的溶液,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。取5-FU对照品适量,精密称定,加流动相溶解并稀释制成每1 mL含10μg的溶液,即得对照品溶液。取按处方比例制备不含5-FU的空白复乳凝胶,4℃条件下以水为溶剂,配制成含5-FU 10μg/mL的溶液,按供试品溶液制备方法制备,即得空白溶液。

2.4 方法学考察

线性关系考察:精密称取5-FU对照品适量,用流动相溶解并稀释成每 1mL含 5-FU 1 mg的溶液。精密量取 6,10,60,100,140,180μL,分别置 10 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,精密量取20μL,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积（A）为纵坐标、质量浓度（C）为横坐标进行线性回归,得回归方程 A=61.79C-15.18（r=0.9991）。结果表明,5-FU 质量浓度在0.6～18μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取同一供试品溶液,连续进样6次,测定其峰面积。结果 5-FU 的平均峰面积为 648.7,RSD 为 0.11% （n=6）,表明仪器精密度良好。

加样回收试验:精密称取5-FU对照品适量,加水稀释成每1mL含5-FU 1mg的贮备溶液。称取已知含量的5-FU复乳原位凝胶5mL,分别置3个10mL容量瓶中,然后分别加入贮备溶液30,50,70μL,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得相对标示量浓度为80%,100%,120%的溶液,按拟订色谱条件进样测定。结果见表1。

表1 5-FU加样回收试验结果（n=6）

稳定性试验:精密量取同一供试品溶液,分别于 0,2,4,6,12,24 h时测定。结果的 RSD 为 0.72% （n=6）,表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品依法配制供试品溶液,重复进样5次,依法测定。结果的 RSD为1.27%（n=5）,表明该方法重复性良好。

2.5 样品含量测定

精密量取供试品溶液20μL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。依法制备对照品溶液同法测定,按外标法分别计算峰面积。结果批号为 20130915,20130916,20130917的样品中 5-FU含量分别为标示量的 97.34% ,103.57% ,96.86% 。

3 讨论

根据2010年版《中国药典（二部）》5-FU含量测定项中的规定,5-FU测定质量浓度为10μg/mL,故标准曲线制订中5-FU对照品的质量浓度配制在0.6～l8μg/mL范围。其含量测定采用的是紫外法[12],采用高效液相色谱法测定本品主药含量,重复性好、专属性强、灵敏度高、结果准确。

复乳是将水包油（O/W）或油包水（W/O）的初乳进行二次乳化,进一步分散在油相或水相中,形成的多相分散体系。它是抗癌药物和抗病毒药物的良好载体,具有流动性好,可以改善药物的吸收、延缓或控制药物的释放。本研究中先将脂溶性差的药物5-FU制成复乳,并进一步将其制成携带有复乳的原位凝胶,可以提高药物的生物利用度,提高患者的用药依从性。

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