女贞不同种质材料基因组DNA的提取及RAPD引物筛选

赵峰 李碧英 张其文 符伟 张恩华

摘要[目的]提取女贞不同种质材料的基因组DNA，并筛选RAPD引物。[方法]采用改良CTAB法提取女贞基因组DNA，并以此种方法提取的女贞基因组DNA为模板，对RAPD引物进行PCR扩增，筛选有效引物。[结果]筛选出21个多态性丰富、条带清晰且重复性好的有效引物，经检测所获得的基因组DNA条带清晰，且OD260/OD280在1.8左右。用筛选出的21个有效引物对126份女贞种质材料进行RAPDPCR扩增，均可获得带型丰富且清晰可辨的DNA 指纹图谱。[结论]该方法为快速和准确地应用RAPD方法分析女贞种质材料的遗传多样性提供了依据。

关键词女贞（Ligustrum lucidum Ait.）；改良CTAB法；RAPD 标记；引物筛选

中图分类号Q781文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00024-05

基金项目海南省教育厅基金资助项目（编号：Hjkj201251）。

作者简介赵峰（1981-），女，山东章丘人，讲师，硕士，从事农学研究，Email：928662418@ qq.com。*通讯作者，讲师，Email：404281096@qq.com。

收稿日期20131209女贞（Ligustrum lucidum Ait.）是木犀科（Oleaceae）女贞属（Ligustrum）常绿灌木或小乔木植物，其果实、种子、树皮、叶和根均可入药，且毒性较低[1]。女贞苦丁茶作为代茶饮料植物，性味凉、苦后回甘，具有生津止渴、抗肿瘤、护肝、调节免疫系统、延缓衰老、抗炎、降血脂和降血糖等多种保健作用[2-4]。女贞子（FRUCTUS LIGUSTRI LUCIDI）中主要含有三萜类化合物、黄酮类、裂环环烯醚萜类及多糖、氨基酸、脂肪酸、挥发油、色素、矿物质等多种化学成分[5]。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）是由Williams和Welsh在1990年各自独立发现的一种DNA多态检测技术[6-7]。该方法具有操作简单、试验成本低廉等优点而被广泛应用于植物种质资源遗传多样性的检测、种质与品种鉴定、种间关系确定和种下划分等分类学问题的研究[8-15] 。有效提取基因组DNA和寻找适宜的RAPD引物是探讨女贞种质资源不同居群间的亲缘关系及遗传多样性的关键因素。笔者提取女贞不同种质材料的基因组DNA，并筛选RAPD引物，以期为快速和准确地应用RAPD方法分析女贞种质材料的遗传多样性提供依据。

1材料与方法

1.1材料分别从海南大学苦丁茶种质资源库所定植的来自不同地域的126份女贞种质材料中，取其嫩芽作为试验的供试材料；各份种质材料的编号和原产地如表1所示。

材料编号原产地材料编号原产地NZ017贵州省湄潭县城NZ082湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ018贵州省湄潭县NZ083湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ019贵州省湄潭县NZ084湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ020贵州省湄潭县NZ086湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ021贵州省湄潭县NZ087湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ022贵州省湄潭县NZ088湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ023贵州省台江县城NZ089湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ024贵州省台江县城NZ090湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ025贵州省台江县城NZ091湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ026贵州省台江县城NZ092湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ028云南省西畴县法斗乡NZ093湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ029江西省南昌市NZ094湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ030湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ095湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ031湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ096湖南省祁东县步云桥乡双江村对塘组NZ032湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ097南京农业大学校园NZ033湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ098南京农业大学校园NZ034湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ099南京农业大学校园NZ035湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ100南京农业大学校园NZ036湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ101南京农业大学校园NZ037湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ102南京农业大学校园NZ038湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ104南京农业大学校园NZ039湖南省祁东县步云桥镇双江村对塘组NZ105南京农业大学校园NZ041湖南省祁东县白鹤铺镇排山村站冲组NZ106南京农业大学校园NZ042湖南省祁东县白鹤铺镇排山村站冲组NZ107南京农业大学校园NZ043湖南省祁东县白鹤铺镇排山村站冲组NZ110南京农业大学校园NZ044湖南省祁东县白鹤铺镇排山村站冲组NZ111南京农业大学校园NZ045湖南省祁东县白鹤铺镇排山村站冲组NZ112南京农业大学校园NZ046湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ113南京农业大学校园NZ047湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ114南京农业大学校园NZ048湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ115南京农业大学校园NZ049湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ116南京农业大学校园NZ050湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ117南京农业大学校园NZ051湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ118南京农业大学校园NZ052湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ119南京农业大学校园NZ053湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ120南京农业大学校园NZ054湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ121南京农业大学校园NZ055湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ122南京农业大学校园NZ056湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ123四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ057湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ124四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ058湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ125四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ059湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ126四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ060湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ127四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ061湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ128四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ062湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ130四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ063湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ131四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ064湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ132四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ065湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ133四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ066湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ134四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ067湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ135四川省巴中市平梁乡北岩村五组NZ068湖南省祁东县白鹤铺镇高原村高原组NZ136四川省巴中市平梁乡北岩村五组

1.2方法

1.2.1基因组DNA 提取。用改良CTAB法提取基因组DNA[16]，仅降低提取液和琉基乙醇的浓度，即3×CTAB变为2×CTAB，硫基乙醇浓度2.7%。所提取的基因组DNA用紫外分光光度计测定OD值，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性；最后将样品释稀成20 ng/μl，用于RAPD反应体系的引物筛选。

1.2.2RAPD引物筛选。根据所购引物的理论退火温度，在此理论退火温度范围内对75个引物设计2个温度梯度；即38和39 ℃，在94 ℃预变性4 min，然后按94 ℃变性30 s，退火45 s，72 ℃延伸2 min，进行40个循环，最后72 ℃延伸10 min。

取扩增产物8和2 μl上样缓冲液（含40%蔗糖和0.25%溴酚蓝）混匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml EB）的上样孔中，以100 bp的DNA ladder作为对照分子量标准，在0.5×TBE缓冲液中电压5 V/cm电泳2.0 h，然后在UVP型凝胶成像系统下照相并记录，检验并分析引物筛选结果。

2结果与分析

2.1基因组DNA提取及检测

2.1.1基因组DNA提取。用改良后的CTAB法提取126份女贞苦丁茶种质材料的基因组DNA，经用紫外分光光度计检测OD值（见表2）。结果显示，其OD260/OD280均在1.80左右，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（图1～2），DNA片段条带清晰，无弥散现象。

2.1.2基因组DNA的RAPD扩增结果。试验结果表明，所设对照中没有扩增出条带（图2中泳道1）；当模板浓度在10～320 ng范围内，所扩增出的带型基本一致（图2中泳道2～8）。另外，用S60号引物对126份种质材料进行RAPD扩增，均能获得条带清晰，稳定且丰富的条带（图3～4）。由此可见，试验中所采用的DNA提取方法是切实可行的。

3结论

作者参考李娟玲等的方法和步骤[16]，适当降低CTAB（即用2×CTAB替换3×CTAB）和巯基乙醇的用量（巯基乙醇2.7%），提取女贞不同种质材料的基因组DNA，并筛选RAPD引物，结果表明，女贞总DNA的OD值均在1.7～1.9，浓度在231.8～2 553.1 μg/ml。用这种方法提取的基因组DNA为模板，成功筛选出了21个适合女贞RAPD标记的有效引物，分别用这21个有效引物对126份女贞种质材料扩增，均能扩增出清晰、稳定且丰富的条带。

综上所述，用改良的方法提取女贞属基因组DNA，能有效排除三萜类化合物、黄酮类、裂环环烯醚萜类及多糖等类化合物的干扰。筛选出来的有效引物特异性强，为RAPD标记快速、准确地分析女贞不同居群中种质材料的遗传多样性以及各居群种质材料之间的亲缘关系，种质材料的分类以及杂交育种等方面的研究提供了分子生物学依据。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2005年版一部）[S].北京：化学工业出版社，2005：31.

[2] 刘国民.中国木犀科代茶植物的多样性与开发状况[J].贵州科学，2003，21（1/2）：69-77.