涂层毛细管胶束电动色谱法快速测定三聚氰胺

石晓燕等

摘要 [目的]初步建立了涂层毛细管胶束电动色谱快速测定三聚氰胺含量的简便方法。[方法]以40 mmol/L磷酸二氢钠和20 mmol/L十二烷基硫酸钠（SDS）为分离缓冲溶液，以石英毛细管为分离柱，于234 nm波长处检测，采用峰高外标法定量。通过对分离缓冲液的组分、石英毛细管涂层、pH及电压对三聚氰胺分析的影响进行研究。[结果]该方法检出限0.48 mg/L，线性范围为10～500 mg/L，线性相关系数0.998 5，三聚氰胺出峰时间小于0.8 min。[结论]通过改进样品处理和试验操作方法，提高回收率，可望满足乳制品中三聚氰胺的定性、定量测定。

关键词 胶束电动色谱；涂层毛细管；三聚氰胺；三甲基氯硅烷

中图分类号 S121 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03374-02

Abstract [Objective] A preliminary， simple， and rapid micellar electrokinetic chromatography （MEKC） method was established for determination of melamine using coated capillary. [Method] The chromatographic separation was carried out in a coated capillary with a separation buffer composed of 40 mmol/L disodium hydrogen phosphate and 20 mmol/L sodium dodecyl sulfate （SDS）. Melamine was detected at 234 nm and quantified by peakheight external standard method. The effects of components of buffer， trimethylchlorosilane coating， pH and applied voltage were investigated. [Result] The detection limits of the method were 0.48 mg/L. The linear range was from 10 to 500 mg/L with a correlation coefficient of 0.998 5. Melamine peak appeared less than 0.8 min. [Conclusion] Through perfecting sample treatment and experiment operation method， the recovery rate was improved， which can satisfy the qualitative and quantitative determination of melamine in dairy products.

Key words Micellar electrokinetic chromatography； Coated capillary； Melamine； Trimethylchlorosilane

2008年9月爆发了三鹿婴幼儿奶粉事件，其非法添加物为高含氮量的三聚氰胺。此后，三聚氰胺的分析测定方法研究受到了广泛的关注[1]。用于测定食品中三聚氰胺含量的先进方法主要有高效液相色谱法[2-3]、气相色谱-质谱联用法[4]、液相色谱-质谱联用法[5]、亲水作用色谱[6]、毛细管电泳法[7-8]和低温等离子体探针串联质谱法[9]。胶束电动毛细管色谱（MEKC）是色谱和电泳原理的结合性电泳技术，也是毛细管电泳中发展较快且应用广泛的技术，能同时分离中性分子和带电离子，它弥补了毛细管区带电泳无法分离中性粒子的缺陷。因此最初主要用于不带电物质的分离，近年来应用范围逐渐扩大，只要分析物在电荷大小形态稍有差别，即可以得到有效的分离[10-11]。依据有机硅羟基保护剂原理，三甲基氯硅烷可以容易地与毛细管内壁结合，当分离缓冲溶液通过后，其SDS的疏水基团就会与三甲基硅基通过疏水相互作用结合，从而形成双涂层，增大了电渗流，缩短了分离时间，提高了分离效率[12]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

P/ACE MDQ毛细管电泳仪（带二极管阵列检测器），美国Beckman公司；PHS3C型酸度计，上海大普仪器有限公司。三聚氰胺，分析纯，天津市巴斯夫化工试剂有限公司；三甲基氯硅烷、十二烷基硫酸钠（SDS），化学纯，上海展云化工有限公司；磷酸二氢钠，化学纯，上海化学试剂采购供应站；其他试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 三聚氰胺标准溶液。

称取50.0 mg三聚氰胺标准品于50 ml容量瓶中，加100 mmol/L醋酸溶液溶解，用100 mmol/L醋酸溶液稀释定容，配制成质量浓度为1 000 mg/L标准储备溶液。

1.2.2 SDS标准溶液。

准确称取2.883 8 g SDS标准品于100 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水溶解，用蒸馏水稀释定容，配制成摩尔浓度100 mmol/L标准储备溶液。

1.2.3 磷酸二氢钠标准溶液。

准确称取2.34 g标准品于100 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水溶解，用蒸馏水稀释定容，配制成150 mmol/L标准储备溶液。

1.3 涂敷液制备

把乙腈和三甲基氯硅烷按9∶1的体积比准确量取，倒入50 ml容量瓶中，振荡摇匀，作为涂敷液备用。

1.4 样品预处理

取添加一定量三聚氰胺的纯牛奶样品（即人工纯牛奶样）20 ml加入100 mmol/L 醋酸溶液20 ml稀释，用力振摇，9 000 r/min 离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后进行MEKC分析。

1.5 电泳条件

毛细管：总长31.2 cm（有效长度21 cm）×75 μm 内径；分离缓冲液：40 mmol/L 磷酸二氢钠、20 mmol/L SDS（pH 4.0）；样品缓冲液：酒精与蒸馏水1∶1（体积比）的溶液；分离电压：20 kV；检测波长：234 nm；操作温度：25 ℃；进样压力及时间：3.447 4 kPa、5 s。

1.6 毛细管的洗涂处理

新的毛细管分别用600 mmol/L盐酸洗5 min，500 mmol/L氢氧化钠溶液洗5 min，蒸馏水洗5 min，用乙腈洗2次，每次5 min，然后用涂敷液洗2 min，分离缓冲液洗10 min。每次进样前，分别用盐酸溶液、氢氧化钠溶液、蒸馏水各洗0.5 min 后，乙腈洗2次，每次0.5 min，涂敷液洗1 min，分离缓冲液洗1 min。

2 结果与分析

2.1 涂层及波长选择

考察在电压、分离缓冲液组分、pH及吸收波长等条件相同下涂层对分离的影响。结果表明，没有涂层条件下基线不稳，柱效不高，还容易出现倒峰，所以选择毛细管涂层。在涂层条件下，考察了波长210～254 nm的出峰情况，综合考虑峰的高低、形状和柱效，选择波长为234 nm。

2.2 磷酸二氢钠浓度的影响

考察了缓冲液中磷酸二氢钠在10～50 mmol/L 浓度范围的影响。结果表明，随磷酸二氢钠浓度的增大，三聚氰胺峰迁移时间变化不大，但峰高明显增高。以人工纯牛奶样测试，过高浓度和低浓度的磷酸二氢钠缓冲液下三聚氰胺与杂质峰重叠，分离效果不好。综合考虑分离效果和柱效，试验采用40 mmol/L 磷酸二氢钠。

2.3 pH的影响

考察了pH 2.0～6.0对三聚氰胺分离的影响。结果表明，随着pH减小，迁移时间增长，峰也增高，与杂质峰重叠较少，分离选择性变好，但在pH 2.0时多次掉电流，所以不能选pH 2.0。综合考虑迁移时间和分析选择性，选择pH 为4.0。

2.4 运行电压的影响

考察了电压16～24 kV的影响。结果表明，当电压增大时迁移时间减短，峰高降低。但考虑电压越高会导致高电流引起焦耳热问题，选择电压为20 kV。

2.5 稀释液选择

试验结果表明，以蒸馏水为稀释液时容易掉电流，出现后拖尾、峰分叉、与杂质峰重叠等情况。以100 mmol/L醋酸溶液为稀释液时，峰形差，且容易掉电流。试验又以20～60 mmol/L磷酸二氢钠溶液为稀释液，结果出现后拖尾现象，样品峰与杂质峰重叠。最后以酒精∶蒸馏水1∶1（体积比）为稀释液，分离效果好，峰形较理想，所以选择它为样品稀释液。

2.6 精密度

在优化电泳条件下，对三聚氰胺标准溶液连续平行测定5次，计算得到三聚氰胺标准溶液电泳图中迁移时间的相对标准偏差（RSD）和峰高的RSD分别为1.7%和3.8%。

2.7 工作曲线、线性范围、检出限

试验测得线性回归方程为Y=0.309 54X-0.000 01（Y为峰高，X为浓度），相关系数0.998 5，线性范围10～500 mg/L，定量限为10 mg/L，检出限为0.48 mg/L。

2.8 样品分析

用MECC方法测得三聚氰胺标准溶液的电泳图如图1，图中峰1为三聚氰胺峰。 某纯牛奶加入一定量三聚氰胺标准溶液，经过预处理后，测得样品中三聚氰胺的电泳图如图2，图中峰1为三聚氰胺峰。

2.9 回收率

取测试过的人工牛奶样，加入三聚氰胺标准溶液，搅拌均匀，在优化电泳条件下测得峰高，平行5次，计算得平均回收率为91.3%。

3 结论

采用加涂层的胶束电动毛细管色谱-二极管阵列检测的方法，三聚氰胺在0.8 min内出峰，线性关系好，检测限低。

通过改进样品处理和试验操作方法，提高回收率，可望满足乳制品中三聚氰胺的定性、定量测定。

参考文献

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