不同程度牙周炎龈沟液中一氧化氮含量的研究

徐利东　任娟　石瑾

【摘要】目的检测不同程度牙周炎患者龈沟液中NO的含量变化，观察NO表达与牙周炎发生发展的关系。方法选择牙周健康者10例作为正常对照组，选择轻、中、重度牙周炎患者各10例作为实验组。分别采集龈沟液样本，采用硝酸还原酶法检测NO含量，并对结果进行统计学检验。结果实验组与正常对照组中NO含量具有显著地统计学差异（P<0.01），且各实验组中NO含量也具有统计学差异。随牙周炎的病变程度加重，龈沟液中NO含量存在升高趋势。结论NO可以存在于牙周健康及牙周炎患者的龈沟液中，且其含量的变化与牙周炎的发生发展存在密切关系。

【关键词】一氧化氮；龈沟液；牙周炎

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种毒性强，不稳定，易扩散，化学性质活泼，半衰期极短的自由基[1-2]，是一种特殊的多功能的信号分子和效应分子在机体内可充当信使、介质和细胞功能调节因子，对多种器官、系统的功能具有重要的调节作用，参与众多的生理病理过程。随着NO在唾液中的检出，其在口腔疾病中作用的研究正逐渐成为口腔研究领域的热点之一。内源性NO以L-精氨酸为底物，由一氧化氮合酶（nitric oxide syntheses，NOS）催化合成，可在体内广泛存在，研究表明，NO可以参与牙周微循环的调节，并且在牙周炎患者与牙周健康者的唾液、龈沟液及牙龈组织中NO的含量有明显区别[3]。

本实验通过检测不同严重程度牙周炎患者龈沟液中NO的含量，观察NO的表达与牙周炎发生发展之间的关系。

1资料与方法

1.1仪器与材料一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）；721型可见光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（湖南仪器仪表厂）；可调式移液器（型号：YYQ-1000P，北京明力普瑞科技有限公司）

1.2研究对象及分组从我院口腔科门诊就诊患者中随机选择慢性牙周炎患者30例作为研究对象，其中男33例，女27例。纳入标准：①1年内未进行过任何牙周治疗。②临床检查和X线片诊断为全口多数牙牙周袋形成，牙槽骨吸收。③每位患者全口余留牙≥20个。④6个月内未服用过抗生素或免疫抑制剂。⑤全身健康，无免疫缺陷病、内分泌等系统性疾病。⑥女性患者不在妊娠、哺乳期。对研究对象进行牙周探诊，根据附着丧失（clinical attachment loss，CAL）程度分别分为轻、中、重度组。轻度组：至少15个位点附着丧失≤4mm；中度组：至少15个位点附着丧失在3-5mm之间；重度组：至少15个位点附着丧失≥5mm[4]。另选牙周健康的本院职工10例作为正常对照组，其中男13例，女15例。所有受试者均知情同意，自愿参加本研究。

1.3实验方法根据牙周探诊记录，选择实验组牙周炎患者口内两个以上不同象限2-4颗病变最严重牙位和对照组牙周健康者4颗第一磨牙作为取样牙，均分别在牙齿颊、舌侧的近、远中点取样。去除取样牙龈上菌斑及牙石，受试者清水漱口后，隔湿取样牙，轻轻吹干牙面，1min后，将已称重的2mm×8mm Whatman濾纸条轻轻插入龈沟或牙周袋内至遇有轻微阻力时止，留置30s后取出，迅速放入Eppendorf管中。将每颗牙的4条滤纸条作为一份样本置入同一Eppendorf管中。弃去带血或明显被唾液污染的样本。根据取样前、后滤纸条重量差换算出GCF体积，定量后将样本密封、-20℃冻存、待检。取样后记录CAL、牙周袋探诊深度（pocketprobing depth，PPD）和出血指数（bleeding index，BI）。

1.4NO测定将冻存样本常温下解冻，每管加入PBS液（0.01mol/L，pH7.4）300μl，室温振荡1h，4℃，10000r/min离心10min，弃去滤纸条，上清液4℃保存。取上清液100μl按NO试剂盒说明通过硝酸还原酶法检测GCF样本中NO水平，每样本均设复管，空白对照为100μl双蒸水。各样本分别于721型分光光度计550nm波长、0.5cm光径比色测定光密度，根据试剂盒提供公式计算GCF样本中NO浓度，单位为μmol/L。

1.5统计学处理各指标以位点牙为单位，实验数据以均数±标准差（χ±s）表示，采用SPSS11.0软件包对数据进行Student t-test检验。

2结果

2.1研究对象及取样牙位一般情况本组研究对象共40人，男28人、女12人。其中轻、中、重度组10人，平均年龄分别为43.9±2.6、42.5±2.2、43.6±1.8岁；对照组10人，平均年龄43.1±2.6岁，实验与对照组年龄的差异无统计学意义（P>0.05）。四组取样牙BI、PPD、CAL的差异均具有统计学意义（P<0.01），说明各组间牙周状态存在显著差异，见表1。

3讨论

NO是一种特殊的多功能的信号分子和效应分子在机体内可充当信使、介质和细胞功能调节因子，对多种器官、系统的功能具有重要的调节作用，参与众多的生理病理过程。

研究显示，NO信号通路除可以在心血管系统、神经系统等发挥效用外，还可与机体的免疫功能特别是机体的非特异性宿主防御反应有关。NO介导了LPS、TNF、IL-1等细胞因子的病理作用，调节白细胞与EC粘附，抑制T细胞增殖，提高NK细胞活性等，这些均显示了NO与机体免疫功能密切相关[5]。而LPS、TNF、IL-1均参与了牙周病的发生发展过程。国内外已有学者[3-7]在牙周病患者的唾液及龈沟液中检测出了NO，说明NO参与了牙周病的进程。本实验在不同程度的牙周炎患者的龈沟液中均检测出了NO且其含量要高于相对正常对照组，也再一次验证了这一结论。

龈沟液从牙龈结缔组织通过沟内上皮和结合上皮渗入到龈沟中的液体，其主要成分与血清相似。包括补体-抗体系统的成分、各种电解质、蛋白质、葡萄糖、酶等，其他成分来自则可邻近牙周组织还有细菌及其他微生物[4]。由于其来自牙周组织，可与牙周病的严重程度和活动期有一定关系。

龈沟液中成分的变化可较准确地反映牙周组织的状态，对牙周炎活动期的诊断、预测疾病的发展等均具有重要意义。目前，各类研究中多采集唾液中的NO来研究其与牙周病的关系，而分析龈沟液中NO含量变化的文献仍较少见。通过本研究通过采集不同程度牙周炎患者的龈沟液，采用硝酸还原酶法检测NO含量发现，在正常对照组及各实验组中均存在有NO，但实验组龈沟液中NO的含量要远远高于正常对照组，且随着牙周炎程度的加重，NO的含量也在增加。本结果与国内学者葛颂、龚斌[6-7]的研究结果一致，说明NO参与了牙周炎的发生与发展，也为进一步研究NO在牙周炎中的作用机制奠定了实验基础。

参考文献

[1]Anggard E.Nitric Oxide：mediator，murderer and medicine.Lancet，1994，343（8907）：1199-1206.

[2]Lowenstein CJ，Snyder SH.Nitric oxide，a novel biologic messenger [J].Cell，1992，70：705-707.

[3]Vanessa G.S.Reher，Elton G.Zenóbio，Fernando O.Costa，et al.Nitric oxide levels in saliva increase with severity of chronic periodontitis[J].Journal of Oral Science，2007，49，（4）：271-276.

[4]曹采方.牙周病學[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2000.11.120.

[5]Pacher P，Beckman JS，Liaudet L.Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease [J].Physiol Rev，2007，87（1）：315-424.

[6]龚斌，徐静舒，戚慧，等.正常人、牙龈炎和牙周炎患者龈沟液内一氧化氮含量的检测[J].口腔医学研究，2011，27（5）：431-433.

[7]葛颂，何权敏，蔡树玉.龈沟液一氧化氮含量与牙周炎症的关系[J].遵义医学院学报，2008，31（2）：123-125.