CryIAc和Sck双价抗虫基因遗传转化甘蔗的研究

吴转娣等

摘 要 将双价抗虫基因，即修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（Cry1Ac）和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（sck）导入甘蔗优良品种ROC22，获得潮霉素抗性转化植株95株，35株能检测到外源抗虫基因，获得的13株RT-PCR双基因均呈阳性的甘蔗植株，斑点杂交检测有4株呈阳性。结果表明：外源抗虫基因已导入甘蔗基因组中。

关键词 甘蔗；根癌农杆菌介导法；Cry1Ac；sck；遗传转化

中图分类号 S688 文献标识码 A

Abstract In the paper sugarcane， the cultivar ROC22 was genetically transformed with both Cry1Ac gene and sck gene， and selected with hygromycin B via agrobacterium-mediated transformation system. 95 transformed plantlets were obtained， and 35 of them showed positive by polymerase chain reaction. Furthermore， thirteen PCR-positive plantlets were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction， all were positive. Thirteen of the RT-PCR-positive plants were taken for dot blot analysis， four of which were positive. The result showed that foreign genes were integrated into the sugarcane genome.

Key words Sugarcane； Agrobacterium-mediated； Cry1Ac； sck； Genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.023

甘蔗抗虫基因工程育种一直是甘蔗产业的重要发展方向，每年中国甘蔗产业因螟虫危害导致的损失高达数十亿，甚至上百亿元，另外每年数十万吨剧毒农药投入蔗田，杀虫效果并不理想，反而加重了害虫的抗性，并导致严重的环境污染和人畜中毒事故[1]。近年来，随着中国经济的发展，农村人口大量进入城市，甘蔗产业生产方式也发生了改变，为确保甘蔗产业的可持续发展和食糖安全，迫切需要利用基因工程技术培育和发展抗虫转基因甘蔗新品种。利用基因工程技术将杀虫蛋白基因导入植物中提高植物的抗虫性，已成为当今植物基因工程的研究热点之一。目前转基因甘蔗的技术已成熟，已有许多获得转基因植株的报道[2-8]。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫具有髙度特异性，是目前应用最广泛的抗虫基因[9]。1997年，Arencibia等[10-11]首次将经过修饰的Cry1A（b）基因导入甘蔗并获得了表达。2006年Weng等[12]为提高m-Cry1Ac的表达，对基因进行了密码子的改造，并将其GC含量提高到47.5%，在Ubi启动子驱动下导入甘蔗YT79-177和ROC16，经免疫分析确定，有18个转基因株系表达，饲喂于甘蔗蛀茎虫，1周内全部死亡，而对照品种的叶茎则遭受严重虫害。之后Weng[13]再次将GC含量提高到54.8%，再一次提高了Cry1Ac基因的表达量，达到了2.2～50 ng/mg。冯翠莲等[14-15]构建了Cry1Ab和Cry1A（c）基因的植物表达载体，通过农杆菌介导法转化甘蔗，均获得了阳性植株。

豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI）来自豇豆的可食用部分，其抗虫谱广、对人畜无副作用及昆虫不易产生耐受性，是继Bt基因之后应用较广的抗虫基因。CpTI基因已被转到烟草、水稻、棉花等许多作物中。1997年澳大利亚Nutt等[16]、2001年Braga等[17]分别将马铃薯蛋白酶抑制剂基因和Bt基因转入甘蔗，获得了对蛴螬及螟虫具有抗性的植株。2003年，Falco[18]将大豆孔尼兹胰岛素抑制剂（SKTI）和包曼-布瑞克抑制剂（SBBI）基因导入甘蔗基因组并得到表达，获得了在一定程度上抵抗甘蔗钻心虫的转基因植株，但田间抗性不甚理想，钻心虫仍能对其产生危害。而修饰的cpti基因被导入水稻、棉花植株获得了很好的抗虫性[19，20]，实验证明转修饰cpti基因的植物无论是抗虫蛋白含量还是抗虫能力均比转野生型cpti基因植物有显著的提高[21]。Christy等[22]2009年将抑制甘蔗螟虫生长的抑肽酶合成基因导入甘蔗中，经测定转基因甘蔗的抑肽酶水平发生变化，在生测试验中，喂食了转基因甘蔗的螟虫幼虫重量显著降低，其生长发育受到严重影响。2010年，Arvinth等[23]将经过密码子改造的Cry1Ab基因单个导入已转胰蛋白酶抑制剂基因的甘蔗中，在双基因的转基因甘蔗中其枯心率比转Cry1Ab单基因植株更低，表明Cry1Ab基因与抑制剂基因在转基因甘蔗中存在协同效应。

本研究以甘蔗品种ROC22为转化受体，潮霉素为筛选标记，通过农杆菌介导法将双价抗虫基因，即修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（Cry1Ac）和修饰的豇豆蛋白酶抑制基因（sck）导入甘蔗，获得高效广谱的抗虫甘蔗新品系。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗材料为新台糖22（ROC22），采自云南省农业科学院甘蔗研究所所内基地。植物表达载体pCDMARUBAC-Hpt由云南农业大学曾千春研究员提供，农杆菌菌株EHA105为本实验室保存。

pCDMARUBAC-Hpt含潮霉素磷酸转移酶基因（Hpt）、修饰的豇豆胰蛋白酶抑制基因（sck）及修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（Cry1Ac），筛选标记和抗虫基因分别置于2个独立的T-DNA区（图1）。

Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、凝胶回收试剂盒、Marker均购自TaKaRa公司；卡那霉素（Kan）、链霉素（Str）、羟苄青霉素（Car）、利福平（Rif）等购自Sigma公司，PCR引物合成和测序由上海生物工程服务有限公司完成。RNA提取试剂盒购自OMEGA公司，反转录试剂盒购自Promega公司，地高辛标记与检测试剂盒购自Roche公司，其他常用的分子生物学试剂主要购自上海生物工程服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 农杆菌的转化 利用常规的CaCl2法制备农杆菌感受态细胞，再以“冻融法”将植物表达载体pCDMARUBAC-Hpt导入农杆菌EHA105中[24]。

1.2.2 甘蔗的遗传转化 （1）甘蔗胚性愈伤组织的诱导。选择处于拔节期生长健壮的甘蔗植株，取顶端茎段，于超净工作台中剥取甘蔗的幼嫩叶片作为外植体，将其切成1 mm的薄片，接种于愈伤诱导培养中，（25±1）℃暗培养约6～8周，每2周转接至新的愈伤继代培养基中，获得胚性愈伤组织。

（2）农杆菌的活化。将含有pCDMARUBAC-Hpt的EHA105菌种涂板于三抗（含有Kan 50 μg/mL，Str 50 μg/mL，Rif 50 μg/mL）YEP固体培养基中（28±1）℃暗培养3 d，挑取单菌落于液体三抗YEP培养约18 h。

离心收集菌体并用液体转化培养基重悬，添加150 μmol/L的AS（乙酰丁香酮），（22±1）℃，100 r/min摇动培养2 h，获得工程菌液。

（3）胚性愈伤组织的预处理。转化前将胚性愈伤组织转接至新鲜继代培养基中培养4 d，置于无菌的滤纸上再吹1～2 h，至组织块表面干燥，稍有收缩，即可用于浸染试验。

（4）转化。将组织块置于农杆菌工作菌液中浸泡约30～40 min，期间10 min摇动1次。滤去菌液转移至滤纸上晾干，表面干爽、无水膜时，切成0.3～0.5 cm的小块。转接至含100 μmol/L的AS固体转化培养基上，（ 22±1）℃黑暗培养3～4 d。

（5）分化与筛选。将胚性愈伤组织转移到含有Car 200 mg/L，潮霉素10.0 mg/L的分化培养基上，28 ℃弱光照（500～800 lx）下培养3周。转接至丛芽诱导培养基中，依次添加浓度梯度为20.0、30.0、40.0 mg/L的潮霉素，对分化幼苗进行筛选，并培养出丛生芽。再转接到生根培养基中诱导生根，获得转化植株。

1.2.3 转化甘蔗植株DNA的提取及PCR检测

甘蔗转化植株的基因组DNA经CTAB法小量提取获得[26]，测定OD230、OD260和OD280的值，记录OD260/OD230、OD260/OD280和DNA浓度值。根据不同浓度将DNA稀释成50～100 ng/μL。同时经琼脂糖凝胶电泳检测分析。

以总DNA为模板，Cry1Ac、sck基因引物（见表2）扩增目的片段，循环参数为：94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 s。以pCDMARUBAC-Hpt质粒DNA作正对照，以未转化甘蔗的DNA为负对照，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析并照相。PCR产物回收连接PMD-18T载体，导入大肠杆菌送华大公司测序。

1.2.4 RT-PCR检测 取PCR检测Cry1Ac、sck基因均呈阳性的甘蔗植株为材料，非转化植株叶片作为对照，提取甘蔗总RNA。反转录合成cDNA第一链。

以反转录合成的cDNA为模板，Cry1Ac、sck基因引物扩增目的片段，循环参数为：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检测分析。

1.2.5 斑点杂交检测 取RT-PCR呈阳性的甘蔗转化植株总DNA 50 μg，回收Cry1Ac基因扩增产物，连接PMD-18T载体并测序鉴定，酶切产物进行地高辛标记，于尼龙膜上进行斑点杂交，斑点杂交方法参照Roche 公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ试剂盒说明书，质粒pCDMARUBAC-Hpt作为正对照，非转化植株作为负对照。

2 结果与分析

2.1 PCR检测农杆菌的转化

将植物表达载体pCDMARUBAC-Hpt转入农杆菌EHA105，通过单菌落培养和PCR检测证明其已成功导入农杆菌中（图2）。

2.2 甘蔗胚性愈伤组织的诱导和抗性筛选

甘蔗的幼嫩叶片于愈伤诱导培养中培养6～8周，继代培养2次，获得黄白色、表面高低不平呈颗粒状突起、质地较松脆的颗粒状愈伤组织（图3），此类愈伤组织即为胚性愈伤组织，适合用于转化。

采用梯度浓度对转化植株进行筛选，依次添加浓度梯度为10.0、20.0、30.0、40.0 mg/L的潮霉素，获得抗性植株（图3）通过生根培养后炼苗移栽沙床。

2.3 甘蔗总DNA的提取

提取甘蔗抗性植株总DNA，所得DNA的A260/A280值处于1.785～1.918之间，A260/A230处于1.934～2.330之间，说明DNA质量较高，酚类物质、色素、盐和小分子物质等杂质较少，电泳结果见图4。

2.4 PCR检测

提取95株甘蔗抗性植株总DNA，通过Cry1Ac、sck基因引物进行PCR扩增，有35株能扩增到与目的基因大小一致的条带，其中2个基因均扩增出目的条带的有13株，只扩增出Cry1Ac基因的有16株，只扩增出sck基因的有6株。PCR产物回收测序并通过DNA man比对，结果显示与目的基因序列同源性均达100%，初步证明外源基因已整合到甘蔗的基因组中（PCR结果见图5、6）。

2.5 RNA的小量提取和RT-PCR检测

利用Omega RNA提取试剂盒对PCR阳性甘蔗植株及对照甘蔗植株进行RNA的小量提取，部分结果见图7。

以反转录产物为模板，利用上述引物扩增Cry1Ac、sck基因片段，PCR扩增获得了目的条带（部分结果见图8、9）。结果表明，13株PCR呈阳性的甘蔗中，Cry1Ac、sck基因均在转录水平上获得表达。

2.6 斑点杂交

提取了13株PT-PCR阳性甘蔗植株的DNA进行斑点杂交，结果有4株呈阳性（图10），表明Cry1Ac基因已整合到甘蔗基因组中。

3 讨论与结论

以CpTI为代表的植物蛋白酶抑制剂基因抗虫机理不同于Bt基因，它对鳞翅目、鞘翘目和直翅目的许多害虫都有明显的抑制作用，但其杀虫强度不及Bt基因。为了进一步提高转基因植物的抗虫性和扩大其抗虫谱，将2个及2个以上的抗虫基因同时导入植物已成为抗虫分子育种的重要策略。目前报道的使用2个或以上抗虫基因同时转化甘蔗的研究相对较少[27-28]。

植物表达载体pCDMARUBAC-Hpt含双T-DNA（transfer DNA）双抗虫基因，其中筛选标记基因Hpt在一个T-DNA区，2个抗虫基因在另一个T-DNA区。目标基因CpTI基因进行了5′添加信号肽、3′添加内质网定位信号（signal-cpti-KDEL，简称sck） 修饰。为了应对基因沉默，克服转基因的位置效应，在目标基因表达盒的两侧分别融合玉米核基质结合序列（Matrix Attachment Region， 简称MAR），最终形成MAR-抗虫基因表达盒-MAR结构。期望利用这2个抗虫机理和抗虫谱不同基因间的优势互补，获得高效广谱的抗虫甘蔗新品系，有效延长转基因甘蔗的抗虫年限。

本研究通过农杆菌介导甘蔗品种ROC22获得潮霉素抗性植株95株。其中，35个能检测到外源抗虫基因，通过PCR和RT-PCR检测有13株双基因均呈阳性，对13株甘蔗植株进行斑点杂交，有4株呈阳性。同时也开展了转基因甘蔗农艺性状、抗虫性以及遗传稳定相关研究（另文发表）。

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