γ—氨基丁酸对香蕉果实采后成熟的调控作用及其生理机制

胡伟 颜彦 徐碧玉 金志强

摘 要 香蕉是世界上最重要的水果之一，研究香蕉采后成熟与调控对香蕉品质形成及创新采后催熟技术具有重要意义。本实验室前期的研究结果发现MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。本研究在此基础上，根据香蕉果实达到全黄并有黑色斑点期（YB）成熟度的天数为标准，筛选出MaGAD1基因表达的诱导剂γ-氨基丁酸（GABA）能够促进香蕉果实采后成熟。生理学分析结果表明，外源GABA能够促使香蕉果实提前发生生理跃变。实时荧光定量PCR分析结果表明，外源GABA能够诱导MaGAD1和MaACS1上调表达。因此，GABA通过诱导MaGAD1和MaACS1上调表达及促进香蕉果实生理跃变，从而促进香蕉果实采后成熟。本研究不仅从理论上证明了GABA能够促进果实成熟，揭示了GABA促进果实成熟生理机制，并且从实际生产上为蕉催熟的应用提供了一种新方法。

关键词 香蕉；采后成熟；乙烯生物合成；MaGAD1；γ-氨基丁酸

中图分类号 Q344 文献标识码 A

香蕉是世界上最重要的水果之一，也是世界第4大粮食作物。香蕉是典型的呼吸跃变型果实，其采后成熟过程中有大量的乙烯产生，并出现呼吸跃变峰，同时引起生理生化变化，如淀粉转变为糖、多酚的降解、结构碳水化合物的酶解。这些生理变化的发生最终会影响果实的硬度、涩味、香味、颜色及货架期，进而影响到香蕉的商品价值[1]。因此，香蕉采后成熟的研究是香蕉果实生长发育研究的核心内容。研究香蕉采后成熟及调控机理、创新采后催熟技术具有重要的理论意义和实际应用价值。

乙烯是香蕉采后成熟的重要调控因子，它能够诱导香蕉果实发生呼吸跃变，从而导致生理变化和品质形成。ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）是乙烯生物合成途径中的2个关键酶[2]。1999年，Liu等[3]系统研究了乙烯生物合成关键酶基因与香蕉果实采后成熟的关系，实验结果表明，MaACS1和MaACO1与香蕉采后成熟过程密切相关，并且能被外源乙烯诱导；香蕉采后成熟的跃变期乙烯生物合成主要受MaACS1调控，而在跃变后主要受MaACO1调控。2006年，Huang等[4]进一步提出MaACS1是香蕉果实成熟过程中起主要作用的基因。

谷氨酸脱羧酶（GAD）能够与磷酸吡哆醛辅因子结合催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。植物在应对外界刺激时，GAD被细胞内的H+或Ca2+水平的增加而激活，从而导致GABA大量积累。细胞内GABA积累与植物pH调控、N储存、植物发育、果实成熟等生理过程密切相关[5-6]。但GAD及其产物GABA在乙烯生物合成及果实成熟中的作用较少地被研究。Kathiresan等[7]研究发现外源GABA能够通过诱导GAD活力和ACS基因表达，从而促进向日葵内源乙烯的生物合成。另外，先前的研究从番茄、柑橘等果树中分离出1个GAD基因，表达分析结果表明，GAD基因在果实成熟不同阶段具有差异表达的特征[6，8-9]。最近，Liu等[10]从柑橘中分离出2个GAD基因（CsGAD1、CsGAD2），表达分析生理学分析结果表明，随着柑橘果实中可滴定酸含量的降低，CsGAD1基因的表达及GAD活力显著增加。然而，值得注意的是，外施GABA是否能够影响果实成熟尚不明确，外源GABA影响果实成熟的生理机制尚不清楚。

笔者前期的研究利用抑制差减杂交及cDNA微阵列，筛选正常成熟条件下香蕉果实采后乙烯跃变启始时差异表达的基因。结果表明，与采后0 d相比较，GAD基因的cDNA片段的表达量显著上调，并且是所获得的289个cDNA片段中表达量最高的[11-12]。随后，笔者克隆了该基因（MaGAD1），并对其在香蕉采后不同成熟阶段的表达进行分析。结果表明，MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关[13]。本研究以MaGAD1为靶基因，筛选MaGAD1表达的诱导剂，探索MaGAD1表达的诱导剂对香蕉采后成熟的调控作用，揭示其作用的生理机制。这些研究结果不仅从理论上证明GABA能够促进果实成熟及相关生理机制，并且从实际生产上提供一种能够应用于香蕉催熟的新方法。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理

香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian）果实采自中国热带农业科学院香蕉研究所澄迈香蕉种植基地。香蕉断蕾110 d后，采收香蕉果实（成熟度为全绿期），切割成单个果指，用0.1%次氯酸钠进行表面消毒10 min，并用无菌水清洗3次。将香蕉采后成熟过程划分为7个阶段：全绿期（FG）、黄色出现期（TY）、绿多于黄色期（MG）、黄多于绿色期（MY）、绿色轻微存在期（GT）、全黄期（FY）、全黄并有黑色斑点期（YB）[14]。

香蕉果实催熟剂筛选实验将香蕉果实分成3组（每组36个果指）：正常成熟、GABA处理以及几丁聚糖与谷氨酸混合物处理。正常成熟：将香蕉果实放于25 ℃培养室，待其自然成熟，并观察达到YB成熟度的时间。GABA处理：将GABA配成200、20、2 mmol/L共3个浓度梯度（每个浓度处理12个果指），每个浓度下再浸泡香蕉果实5、30、120、240 min等4个时间，然后将其放于25 ℃培养室，观察记录每小组香蕉果实达到YB成熟度的时间（每个处理时间处理3个果指）。几丁聚糖与谷氨酸混合物处理：将几丁聚糖与谷氨酸混合物配成5 000 mg/L+500 mmol/L、500 mg/L+50 mmol/L、50 mg/L+5 mmol/L共3个浓度梯度（每个浓度处理12个果指），每个浓度下再浸泡香蕉果实5、30、120、240 min等4个时间（每个处理时间处理3个果指），然后将其放于25 ℃培养室，观察记录每小组香蕉果实达到YB成熟度的时间。每个样品做3次生物学重复。

GABA处理实验将香蕉果实分成2组（每组21个果指）：正常成熟和GABA处理。正常成熟：将香蕉果实放于25 ℃培养室，待其自然成熟，并观察记录香蕉果实达到每一个成熟度的时间。GABA处理：用2 mmol/L GABA处理香蕉果实240 min，将其放于25 ℃培养室，观察记录香蕉果实达到每一个成熟度的时间。在正常成熟及GABA处理下，香蕉果实达到每一个成熟度时取样测定相关生理指标（每个样品测定3个果指）。另外，以GABA处理香蕉果实达到7个成熟度的时间为标准，对2种处理取样。取样后将果实切成小块立即置于液氮中，保存于-70 ℃冰箱中用以香蕉果实RNA的提取。每个样品做3次生物学重复。

1.2 方法

1.2.1 香蕉果实生理指标的测定 香蕉果实硬度的测定：根据杭州托普仪器有限公司硬度测定仪说明书测定香蕉果实硬度。每个果指测定3次，每个样品测3个果指。

香蕉果实可溶性糖含量的测定：取3个香蕉果指，去除果皮，将果肉切成小块，用液氮冷冻后压碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用8 mL蒸馏水研磨，转入离心管中，用塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min，连续提取2次，提取液过滤入25 mL容量瓶中，定容至刻度。取30 μL样品液加入0.47 mL蒸馏水，再加入9% 0.25 mL苯酚溶液，摇匀，再从管液正面迅速加入 1.25 mL浓硫酸，摇匀。室温下放置30 min，在485 nm波长下测定吸光度[15]。每个样品测定3次。

香蕉果实淀粉含量的测定：取3个香蕉果指，去除果皮，将果肉切成小块，用液氮冷冻后压碎混合。参照徐昌杰等[16]的方法，取0.5 g香蕉果肉，用5 mL 80%乙醇研磨，转入离心管离心，残渣8 mL用80% Ca（NO3）2溶液悬浮后在沸水中温浴10 min，离心后将上清转入25 mL容量瓶中，残渣用80% Ca（NO3）2溶液重复提取2次，合并提取液，定容至25 mL。取淀粉样品1.8 mL，加入0.2 mL 0.01N I2-KI，摇匀，于620 nm下测定光吸收值。每个样品测定3次。

1.2.2 香蕉果实乙烯生物合成相关基因表达分析 首先用NCBI的保守结构域分析软件分析MaACO1、MaACS1、MaGAD1、MaActin1 4个基因的保守区域，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物，并通过测序分析确定引物的准确性。引物序列见表1。在Stratagene的Mx3000P仪器上进行荧光定量PCR。在0.2 mL的PCR反应管中加入SYBR Premix Ex Taq（2×）（TAKARA）12.5 μL、Rox reference DyeⅡ（50×）（TAKARA）0.5 μL、5 μmol/L的1对引物各0.75 μL，cDNA样品1 μL，然后用水补足至25 μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因MaActin1，各个基因的扩增都做3个重复。按照94 ℃预变性3 min，94 ℃变性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环的反应程序进行扩增（4个基因的反应程序是一致的），并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94～55 ℃的融解曲线分析。采用2-△△CT相对定量方法[17]研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，将0 d的cDNA模板视为对照样品，其它天数的视为不同处理的样品，以看家基因MaActin1为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达变化的曲线。每个样品做3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 GAD基因诱导剂对香蕉采后成熟的影响

在正常成熟条件下，香蕉果实达到YB成熟度的时间为8 d。在200 mmol/L GABA处理条件下，与正常成熟相比，处理0～30 min对香蕉果实达到YB成熟度的时间没有变化；处理120 min或240 min，香蕉果实达到YB成熟度的时间为9 d（比正常成熟推迟1 d）。在20 mmol/L GABA处理条件下，与正常成熟相比，处理0～120 min对香蕉果实达到YB成熟度的时间没有变化；处理240 min，香蕉果实达到YB成熟度的时间为7 d（比正常成熟提前1 d）。在2 mmol/L GABA处理条件下，与正常成熟相比，处理0～5 min对香蕉果实达到YB成熟度的时间没有变化；处理30～240 min都能促进香蕉果实成熟（30或120 min比正常成熟提前1 d；240 min比正常成熟提前2 d）。上述结果表明，外施GABA能够促进香蕉果实成熟，最适的处理浓度为2 mmol/L，最适的处理时间为240 min（图1-A）。而且，从图1-C中可以发现，在2 mmol/L GABA处理香蕉果实240 min后，8 d香蕉果实的黑色斑点比正常对照多。所以，GABA对香蕉果实具有显著的催熟效果。

另外，5 000 mg/L几丁聚糖与500 mmol/L 谷氨酸的混合物及500 mg/L几丁聚糖与50 mmol/L 谷氨酸的混合物对香蕉果实成熟没有催熟效果，反而有一定的抑制效果；50 mg/L几丁聚糖与5 mmol/L 谷氨酸的混合物处理30～240 min能够轻微促进香蕉果实成熟。上述结果表明，几丁聚糖与谷氨酸的混合物对香蕉果实的催熟效果不明显（图1-B）。

2.2 GABA对香蕉采后成熟过程的影响

为了进一步确证GABA对香蕉采后果实的催熟作用，用2 mmol/L GABA处理香蕉果实240 min，观察处理后的香蕉果实达到各个成熟度的时间。由表2可知，除了在FG成熟度（采后0 d），GABA处理后香蕉果实达到其它每一个成熟度的时间都比正常对照提前，达TY成熟度时提前1 d，达MG-YB成熟度时提前3 d。上述结果表明，GABA处理能够显著提前香蕉果实达到TY-YB成熟度的时间。

2.3 GABA对香蕉采后生理的影响

在正常成熟条件下，采后香蕉果实的硬度和淀粉含量在0～7 d内缓慢下降，在8～9 d内急剧下降，在9～11 d内缓慢下降（图2-A、B）；可溶性糖含量在0～7 d内缓慢上升，在8～9 d内急剧上升，在9～11 d内缓慢上升（图2-C）。上述结果表明，在正常成熟条件下，香蕉果实在8-9 d出现生理上的显著变化。

在GABA处理条件下，采后香蕉果实的硬度和淀粉在处理后的0～3 d内缓慢下降，在4～5 d内急剧下降，在6～8 d内缓慢下降（图2-D、E）；而可溶性糖含量在0～3 d内缓慢上升，在4～5 d内急剧上升，在6～8 d内缓慢上升（图2-F）。上述结果表明，在GABA处理条件下，香蕉果实在4～5 d出现生理上的显著变化。

2.4 GABA对香蕉采后乙烯生物合成相关基因表达的影响

在正常成熟条件下，MaACO1的表达没有明显的规律（图3-B）；但是，MaGAD1和MaACS1的表达在香蕉采后0～7 d内都维持在较低的水平，在采后第8天显著提高（图3-A、C）。与采后第7天相比较（1.020），MaGAD1表达在采后第8天（5.559）提高了5倍（图3-A）。与采后第7天相比较（1.713），MaACS1表达在采后第8天（3.891）提高了2倍（图3-C）。上述结果表明，MaGAD1和MaACS1的表达在香蕉采后成熟过程中具有一致的趋势，并且在采后第8天显著提高。

在GABA处理条件下，MaGAD1表达量在0～3 d较低1.000～0.241，在第4天达到2.249，在第5天达出现第一次峰值11.270（图3-D）。MaACO1表达量在0～4 d较低1.000～0.496，在第5天达出现第一次峰值3.146（图3-E）。MaACS1表达量在0～3 d较低1.000～0.117，在第4天达到8.269，在第5天出现第一次峰值25.473（图3-F）。上述结果表明，在GABA处理下，MaGAD1表达趋势与MaACS1和MaACO1一致，都在采后第5天出现第一次峰值，比正常成熟达到最大值提前3 d；同时，与正常成熟相比，这3个基因的表达水平都被显著诱导。

3 讨论与结论

根据香蕉采后成熟的划分标准，YB期是香蕉采后成熟的完成期，并且是香蕉采后品质形成的重要阶段[15]。所以，本研究以香蕉果实达到YB成熟度的天数为标准，筛选对采后香蕉果实具有催熟作用的试剂，并确定其最适的处理时间和处理浓度。笔者前期的研究结果发现，MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关[14]。因此可以推测，体外诱导MaGAD1基因上调表达可能会促进香蕉采后成熟。根据这一思路，查阅文献发现，GABA及谷氨酸、几丁聚糖的混合物能够显著诱导GAD基因上调表达[18-19]。所以，分别用GABA及谷氨酸、几丁聚糖的混合物处理香蕉果实，测定处理后的果实达到YB成熟度的时间，从而确定GABA以及谷氨酸和几丁聚糖的混合物对香蕉采后的催熟效果。结果表明，低浓度GABA能够促进香蕉果实成熟，而高浓度GABA轻微推迟了香蕉果实成熟。这一研究结果证实了低浓度GABA能够促进香蕉果实采后成熟。

香蕉是典型的跃变型果实，其采后成熟经历了一系列的呼吸跃变过程。随着呼吸跃变的发生，香蕉果实也产生了相关的生理变化，如果实软化[20]、淀粉降解和可溶性糖含量增加[21-22]。这些生理变化的发生会影响香蕉果实的硬度、芳香物质、颜色和货架期，最终决定了香蕉果实的品质。既然GABA能够显著促进香蕉果实采后成熟，那么是否外施GABA能够影响香蕉果实的生理变化是一个值得探索的问题。所以，笔者测定了正常成熟及GABA处理条件的香蕉果实的硬度、淀粉含量和可溶性糖含量。结果表明，GABA处理导致香蕉果实生理跃变提前4～5 d。这一研究结果从生理学的角度支持了GABA通过影响香蕉采后生理变化促进香蕉果实成熟。

乙烯是香蕉采后成熟的重要调控因子。Liu等[3]报道乙烯生物合成关键酶基因MaACO1和MaACS1在香蕉采后成熟过程中起着重要作用。在香蕉采后成熟过程中，乙烯生物合成关键酶基因的表达促进了乙烯的生物合成、果实的生理变化及品质的形成。所以，笔者推测GABA促进香蕉采后成熟及相关生理跃变可能与乙烯生物合成关键酶基因的表达密切相关。为了确证这一科学问题，笔者测定了在正常成熟及GABA处理条件下香蕉果实MaACO1和MaACS1基因的表达水平。结果表明，GABA处理导致香蕉乙烯生物合成关键酶基因MaACO1和MaACS1的表达出现峰值的时间提前3 d。这一研究结果从分子生物学的角度进一步支持了GABA通过影响MaACO1和MaACS1的表达促进香蕉果实采后成熟。

本研究是根据文献报道GABA能够显著诱导GAD基因上调表达[18]，深入研究GABA对香蕉采后成熟的影响及相关生理机制，那么GABA是否能够诱导MaGAD1上调表达必需得到证实。所以，笔者测定了在正常成熟及GABA处理条件下香蕉果实MaGAD1基因的表达水平。结果表明，GABA能够显著诱导MaGAD1上调表达。而且，在GABA处理条件下，MaGAD1表达峰值出现的时间与MaACS1和MaACO1表达峰值出现的时间一致，并且与香蕉果实生理跃变发生的时间一致。综上所述，GABA通过诱导MaGAD1、MaACS1、MaACO1上调表达和加快香蕉果实生理跃变，来促进香蕉果实的采后成熟。

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责任编辑：黄东杰