芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性测定

蒲金基 张贺 杨石有 杨慧杰 刘晓妹

摘 要 采用生长速率法测定了采自中国芒果主产区、泰国、夏威夷等地的127个芒果炭疽菌对甲基硫菌灵的敏感性。结果表明，芒果炭疽菌株对甲基硫菌灵的EC50值范围为0.005 7～7.850 5 μg/mL，最大EC50值是最小EC50值的1 377倍。不同地区、不同染病部位、不同年份的芒果炭疽菌株对甲基硫菌灵的敏感性不同，采自四川菌株敏感性最低，采自夏威夷菌株敏感性最高；不同分离部位敏感性程度依次为枝、果、叶；2011～2013年，菌株敏感性逐年降低，存在很大的抗药性风险。

关键词 芒果；炭疽病菌；甲基硫菌灵；敏感性

中图分类号 S481 文献标识码 A

芒果炭疽病是芒果生产上发生最普遍、危害最严重的一种病害，在世界芒果种植区内均有发生[1]，也是贮藏期最主要病害之一，已成为芒果产业健康发展的限制性因素之一[2]，其病原菌主要以胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz.& Sacc.]为主。该病主要为害芒果叶片、嫩梢、花序和果实，可造成植株叶枯、梢枯、落花落果和采后果实大量腐烂[3]。病原菌寄主范围极为广泛，除为害芒果外，绝大多数热带亚热带果树均是其重要寄主[4]。

甲基硫菌灵（thiophanate-methyl）又名甲基托布津，由日本曹达株式会社研制开发的一种广谱内吸性低毒杀菌剂，能防治多种真菌病害，具有内吸、预防和治疗作用。甲基硫菌灵与苯菌灵、噻菌灵等苯并咪唑类杀菌剂，是目前生产上防治芒果炭疽病采用的主要杀菌剂[5]。甲基硫菌灵被植物吸收后即转化为多菌灵，主要干扰病原菌菌丝的形成，影响病原菌细胞分裂，孢子萌发长出畸形芽管，从而抑制或杀死病原菌[6]。由于该类药剂作用靶标专一，长期单一使用很容易产生抗药性而导致防效下降或丧失，杀菌剂抗药性行动委员会（FRAC）将其归为高风险类[7]。叶佳等[8]对浙江省杭州、嵊州和嘉兴3地78个葡萄炭疽菌（C. gloeosporioides）抗药性研究发现，其抗性频率为51.3%；陈聃等[9]通过对浙江省108株葡萄炭疽菌对甲基硫菌灵和戊唑醇的抗药性研究发现已有37.04%的菌株对甲基硫菌灵产生了抗药性；陈新建等[10]研究发现芦笋茎枯病菌（Phompsis asparagi）已经对甲基硫菌灵产生严重抗药性；杨炜华等[11]研究发现苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sp. piricola）对甲基硫菌灵已经产生了中度的抗药性。Spalding[12]报道了C. gloeosporioides对苯菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵存在正交互抗性；此外，在南非、印度等国报道了芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性[13-15]。

近年来的田间观测发现，甲基硫菌灵在芒果园内的防治效果有所降低，这可能是敏感性降低或抗药性的缘故，但尚缺乏大量试验数据证实。为全面探讨芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性问题，本研究从中国芒果主产区、美国夏威夷州和泰国等地采集、鉴定127个菌株，开展其对甲基硫菌灵的敏感性测定，绘制敏感性频率分布图，为病害的科学防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 2005年～2013年从海南、广东、广西、云南、四川以及泰国和美国夏威夷州等芒果产区采集感病的叶、茎和果等样品，包括贵妃芒、青黄芒、金煌芒、象牙芒、台农1号芒、红芒、紫花芒、凯特芒、吕宋芒、粤西2号、澳芒R2E2、玉文芒、蛋芒和三年芒等14个品种。所有样品经组织分离、单孢纯化、鉴定后接种于PDA试管斜面培养基上，低温保存备用。累计获得单孢菌株127株，其中海南60株，广东12株，广西16株，四川9株，云南16株，泰国9株，美国夏威夷州5株。

1.1.2 供试药剂 96%甲基硫菌灵（thiophanate-methyl）原药（江苏龙灯化学有限公司），丙酮（分析纯）。

1.2 方法

1.2.1 含药培养基制备 准确称取0.052 1 g 质量分数为96%甲基硫菌灵原药，加入250 mL容量瓶中，用丙酮溶解配成有效成分的质量浓度为200 μg/mL的甲基硫菌灵母液。采用系列浓度稀释法配成不同质量浓度的药剂，用移液枪分别移取不同系列浓度的药剂5 mL加入到冷却至50 ℃左右195 mL的PDA培养基中，充分混合均匀，制成实验所需的含药培养基平板。每处理浓度重复3次，以不加药剂而含等量丙酮的PDA培养基为对照。

1.2.2 芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵敏感性测定

采用菌丝生长速率法[16]。各实验菌株在PDA平板培养好后，用无菌打孔器取d=5 mm的菌饼，移至含不同甲基硫菌灵质量浓度的平板上，每浓度重复3次，28 ℃下黑暗培养4 d后用十字交叉法测量菌落直径，以浓度对数（x）为横轴与抑制菌落生长百分率的机率值（y）为纵轴求甲基硫菌灵对病原菌的毒力回归方程y=ax+b，并计算抑制菌体生长的有效中浓度EC50值及R2。抑制率公式如下[17-18]。

抑制率=×100%

2 结果与分析

2.1 芒果炭疽病菌菌株对甲基硫菌灵敏感性测定结果

127株供试菌株对甲基硫菌灵的敏感性测定结果表明：芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性存在明显的差异；EC50值介于0.005 7～7.850 5 μg/mL之间，平均值为0.878 9 μg/mL，EC50值高于平均值的菌株有33个，占总数的25.98%。菌株Mcg-265（四川省攀枝花市）的EC50 值最大（7.850 5 μg/mL），菌株Mcg-265（海南省乐东县）的EC50 值次之（7.666 6 μg/mL），2者均>7.0 μg/mL；菌株Mcg-112（海南省三亚市）的EC50值最小（0.005 7 μg/mL），最大EC50值是最小值的1 377倍、平均值的9.3倍。供试菌株中已有部分菌株敏感性开始降低，尚未上升为优势群体（图1）。本研究结果所测定得到的平均值可作为芒果炭疽菌的敏感性基线，为后续的抗药性监测与治理提供参考。

2.2 不同地区芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性水平

不同地区的127个菌株对甲基硫菌灵的敏感性测定结果表明：不同地区的芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性存在明显差异；海南菌株EC50值为0.005 7～7.666 6 μg/mL、均值为0.920 2 μg/mL，菌株之间差异最大；四川菌株EC50值为0.341 8～7.850 5 μg/mL、均值最大，菌株之间的差异相对略小；广西菌株EC50值为0.010 9～0.902 2 μg/mL、均值较小，菌株之间的差异中等；不同地区菌株的EC50最大值和最小值同样存在较大差异，海南省的菌株EC50最大值是最小值的1 345倍，泰国的菌株为391倍，而其他地区的差异则在23～84倍（表1）。

2.3 不同染病部位菌株对甲基硫菌灵的敏感性比较

通过对比3个不同分离部位的芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性结果表明：不同分离部位的菌株对甲基硫菌灵的敏感性也存在差异，其中从叶片上分离的菌株对甲基硫菌灵的EC50值为0.005 7～7.850 5 μg/mL、 均值最大（0.914 7 μg/mL），表明分离自叶片的分布范围最广，菌株之间的差异最大；从枝条上分离的菌株对甲基硫菌灵的EC50值为0.013 6～1.285 9 μg/mL、均值最小（0.595 3 μg/mL），表明分离自枝条的EC50值范围与差异程度均低于叶片；不同分离部位的敏感性程度由高到低依次为枝、果、叶（表2）。

2.4 连续3年菌株对甲基硫菌灵的敏感性比较

对比2011～2013年连续3年在国内芒果主产区所采集的菌株对甲基硫菌灵的敏感性发现，供试菌株不同年份的敏感性有所不同，呈下降趋势；EC50均值逐年增高，2012年和2013年分别增加12.37%、25.11%（表3）。表明芒果炭疽病菌的抗药性风险在逐年增加。

3 讨论与结论

利用化学农药防治植物病害是植物病害综合防治措施之一，具有见效快、防病效果好等优点，但如果长期施用单一杀菌剂，则易使病原菌产生抗药性[19]。生产上常用苯菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂来防治芒果炭疽病，随着使用年限和用量的增加，芒果炭疽病菌（C. gloeosporioides）逐渐对该类药剂产生了不同程度的抗药性。

本研究通过127株芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性测定发现，病原菌对甲基硫菌灵的敏感性存在明显差异，不同采集地区、分离部位和菌株收集年份的敏感性差异明显。不同地区菌株之间的差异以海南最大，泰国其次，但均高于美国夏威夷州的菌株。泰国是芒果的重要发源地之一，具有悠久的种植历史，其田间芒果炭疽病防治主要依靠化学药剂，从而导致其病原菌对甲基硫菌灵的敏感性差异较大，EC50均值较高，与中国芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性情况较为类似。而美国夏威夷州由太平洋中的夏威夷群岛组成，离芒果主栽区的距离较远，使用杀菌剂的频次较低，甚至不使用杀菌剂，这与该地菌株的敏感性较高有一定的相关性。从而说明菌株对药剂的敏感性与不同地区的用药水平和施药次数有关，也可能是不同药剂的长期施用或混用，造成了药剂之间的交互抗性或负交互抗性[20]；或者与芒果炭疽病菌的遗传分化有关，而关于遗传分化与抗药性之间的关系有必要进一步深入研究。

通过比较不同分离部位菌株对甲基硫菌灵的敏感性发现，分离自叶片的菌株能够代表供试菌株整体情况，在开展抗药性监测和治理过程中，为便于获得病原菌，可以采集染病叶片，从而确保监测与治理工作的周年实施。

比较2011～2013年所采集的菌株对甲基硫菌灵敏感性的研究结果发现，供试菌株对药剂的敏感性有所下降，EC50均值增长幅度超过10%，其抗药性风险逐年增加，其原因可能是病原菌对甲基硫菌灵所产生的抗药性或因苯并咪唑类杀菌剂的抗药性所致，此需进一步深入研究。

127株菌株中，74.02%菌株的EC50值<平均值0.878 9 μg/mL，而25.98%菌株的EC50值高于平均值，这与叶佳等[8-9]等研究葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）对甲基硫菌灵的结果相似。Kumar等[14]报道分离自印度的芒果炭疽病菌中Cg3菌株对甲基硫菌灵表现了中度抗药性；Sanders等[15]研究南非芒果炭疽病菌对苯并咪唑类的噻菌灵和苯菌灵抗药性发现，8.5%、9.2%菌株分别对噻菌灵或苯菌灵产生中度抗药性，这些研究结果都说明了芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性逐渐降低，有产生抗药性的趋势。

为减缓芒果炭疽病菌对甲基硫菌灵抗药性的产生，生产上应高度重视其抗药性问题，避免长期单一施用苯并咪唑类药剂，推荐轮换或混合用药，加强抗药性检测与治理。芒果炭疽病菌的抗药性问题是一个极其复杂的综合性问题，本研究只进行了室内敏感性测定，仍需对敏感度低的菌株开展遗传稳定性、紫外诱导抗药性以及抗药性分子机制等方面进行研究。

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责任编辑：古小玲