霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对肉鸡人工感染发生的影响

朱连勤 朱风华 朱祖贤 高晨 陈甫 王光 黄凯 宋明明

摘 要：本试验旨在研究霉变饲料和/或添加复方霉菌毒素吸附剂对肉鸡人工感染发生的影响。选取140羽1日龄健康的AA肉鸡随机分成7个组，每组4个重复。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2组饲喂霉变饲料；第3～7组以混合感染病鸡病变组织匀浆饮水制作人工感染疾病模型；第3～7组分别饲喂基础日粮、霉变饲料、霉变饲料+复方霉菌毒素吸附剂、霉变饲料+复方霉菌毒素吸附剂+抗氧化剂、霉变饲料+复方霉菌毒素吸附剂+抗氧化剂+中药增免剂。试验期35d。结果发现，肉鸡摄入霉变饲料与摄入正常饲料相比，提高肉鸡料重比和死淘率，显著降低肉鸡增重、胸腺指数、法氏囊指数，显著降低血清IBDV、H9N1V和NDV抗体水平（P<0.05）。给人工感染肉鸡饲喂霉变饲料与饲喂正常饲料相比，显著提高料重比和死淘率，显著降低肉鸡增重、胸腺指数和脾脏指数，显著降低血清IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-12含量以及LTR，显著降低血清IBDV、H9N1V和NDV抗体水平（P<0.05）。霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂能显著提高混合感染肉鸡增重，并降低料重比和死淘率（P<0.05），显著提高胸腺指数、法氏囊指数（P<0.05），显著提高血清IBDV、H9N1V和NDV抗体水平（P<0.05）。可见，霉变饲料可导致肉鸡免疫功能抑制，加重肉鸡混合感染病情；复方霉菌毒素吸附剂能有效缓解霉变饲料对人工感染肉鸡生产性能、免疫功能和病情的不利影响，抗氧化剂和免疫功能增强剂可减轻霉变饲料的毒性作用。

关键词：霉菌毒素；复方霉菌毒素吸附剂；人工感染；氧化损伤；免疫功能；肉鸡

中图分类号：S816.79 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2014）12-0012-06

霉菌毒素对免疫系统的破坏及对免疫应答抑制是主要的毒性作用之一，导致动物抗病力下降，对病原的易感性增强[1]。但对于饲料霉菌毒素可能造成家禽免疫失败和混合感染多发的风险，却认识不足；普遍认为家禽混合感染是因疫苗免疫失败、免疫抑制性病原、滥用药物等因素导致家禽抗病力下降所致[2]。近年来，许多研究报道饲料中霉菌毒素污染呈现居高不下的态势[3]，已经引起养殖业界的重视。探索霉菌毒素在肉鸡混合感染中扮演的角色，以及复方霉菌毒素吸附剂对肉鸡的保护作用，具有重要的现实意义。本试验旨在通过研究霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对肉鸡混合感染发生的影响，确定霉菌毒素在肉鸡混合感染发生上可能扮演的角色，并进一步验证由本实验室研制的复方霉菌毒素吸附剂的效果，为其在实际生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与处理 选取140羽1日龄的肉鸡，随机分为7组，每组设4个重复。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2组为阳性对照组，饲喂霉变饲料；第3组饲喂基础日粮；第4组饲喂霉变饲料；第5组饲喂添加0.2%复方霉菌毒素吸附剂的霉变饲料；第6组饲喂添加0.2%复方霉菌毒素吸附剂+抗氧化剂的霉变饲料；第7组饲喂添加0.2%复方吸附剂+抗氧化剂+中药增免剂的霉变饲料。第3～7组均以混合感染病鸡病料匀浆饮水制作混合感染疾病模型。试验期35d。

1.2 基础日粮和霉变饲料 基础日粮购自某饲料公司。把基础日粮置于阴暗潮湿处使其自然发霉为霉变饲料，在霉变饲料使用前加入0.15%丙酸钙，混合均匀，抑制霉菌继续生长。配制各组饲料时加入适量禽香。使用前检测霉变饲料中ZEN、DON、FB1和AFB1含量，见表1。

1.3 饲养管理 试验肉鸡均自由采食、饮水，笼养，舍内通风良好，光照、温度和湿度按照饲养规程进行控制，及时清理粪尿，并做好消毒工作。按照常规免疫程序和方法，接种新城疫Ⅳ系+传支H120二联冻干苗、新城疫+禽流感二联油苗和传染性法氏囊病疫苗。

将第1组和第2组受试鸡与其他组受试鸡隔离饲养，防止交叉传染。

1.4 肉鸡混合感染疾病模型的建立 选取混合感染特征明显的病鸡内脏（肝脏、小肠、心脏和肺脏），与生理盐水1：1比例，碾磨成均匀浆液，按照每羽鸡每次0.1ml浆液加入水中，在第7天让肉鸡自由饮入。每天1次，连续4d。

1.5 药品和试剂 复方霉菌毒素吸附剂由青岛农业大学动物营养代谢病与中毒病实验室研制；ConA和MTT购自美国SIGMA公司；RPMI-1640和胎牛血清购自美国GBICO公司；二甲基亚砜购自北京索来宝公司；干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-12（IL-12）等检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；ZEN、DON、FB1、AFB1和鸡新城疫抗体、鸡传染性法氏囊病抗体和禽流感抗体ELISA检测试剂盒购自上海劲马科技生物有限公司。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 生产性能检测 试验至35d时，禁食12h，称取每重复受试鸡体重，称量各组饲料重和剩余饲料重，计算每组受试鸡平均日增重和料重比。

1.6.2 症状和病理变化 试验期间观察并记录肉鸡发病情况及症状，对死亡鸡进行剖检并详细记录病理变化。

1.6.3 死淘率的测定 死淘率（%）=[试验开始时数量（羽）-试验结束时数量（羽）]/试验开始时数量（羽）×100。

1.6.4 外周血淋巴细胞转化率（LTR）的检测 试验至35d时，翅静脉采血1ml，肝素钠抗凝，用MTT法（四甲基偶氮唑盐）测定外周血的LTR。

1.6.5 胸腺、脾脏、法氏囊指数的测定 试验至35d，每组随机杀5羽鸡，准确称量体重，并迅速取出胸腺、脾脏、法氏囊，剔除附着组织，于生理盐水中漂洗，用滤纸吸干，分别称重，计算各脏器指数。

脏器指数（mg/g）=脏器重（mg）/体重（g）

1.6.6 血清中IBDV、H9N1V和NDV抗体水平的检测 在14、21、28和35日龄，每重复随机抽取1羽鸡（做好记号，不重复采血），心脏采血5ml，离心取血清，检测血清中IBDV、H9N1V和NDV抗体的水平。

1.6.7 细胞因子的检测 试验至35d时，用试剂盒检测血清干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-12（IL-12）的含量。

1.7 数据统计分析 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析和最小显著差异检验方法，对各均值进行多重比较，结果用±SD表示。

2 结果

2.1 肉鸡混合感染疾病模型的建立 人工感然肉鸡从14日龄开始出现症状，至21日龄时发病鸡病情加重，27日龄后发病鸡病情趋缓，第4、5、6组肉鸡发病早。发病鸡初期症状为：伸颈、张口呼吸、有啰音，有的咳嗽，流鼻，口腔内有透明粘液；病鸡精神沉郁、食欲减退、羽毛蓬松、翅膀下垂。随着病情加重，除呼吸道症状加剧外，病鸡站立不稳，卧倒或匍匐在地，关节肿大，四肢僵硬且腹部沾有大量粪便，闭眼，反应迟钝。许多鸡的肛门松弛，收缩无力，尾部羽毛粘着石灰渣样的固体物。

解剖可见病鸡腿部肌肉有淤血，有的有出血点，有的则大面积出血；病鸡气囊有积液，有黄色或白色纤维素渗出物；气管内蓄满大量浑浊粘液，并伴有白色或黄色絮状物，有的气管壁大面积出现红肿或出现淤血。部分病鸡腹腔有少量积液，各组病鸡肾脏都出现尿酸盐沉积，表现出明显的“花斑肾”，可见输尿管增宽肿大，内有白色石灰样物充盈；有个别鸡肌胃出现溃疡；各组均有鸡均出现纤维蛋白包心包肝；个别发病鸡脾脏肿胀，可见大小不一的灰白色坏死灶，有的则出现细小的出血点；各组均有病鸡肠道发现出血点；部分病鸡胸腺肿大，有的淤血严重，有的可见明显的出血点；各组病鸡关节内充满白色的胶冻样粘液。

2.2 霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对人工感染肉鸡生产性能和死淘率的影响 与空白对照组相比，饲喂霉变饲料的肉鸡平均日增重显著降低、料重比显著提高（P<0.05），人工感染的肉鸡平均日增重显著降低（P<0.05）、死淘率升高。给人工感染肉鸡饲喂霉变饲料比饲喂正常饲料显著降低平均日增重、显著提高料重比和死淘率（P<0.05）。在人工感染肉鸡采食的霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，显著降低肉鸡死淘率和料重比、提高平均日增重（P<0.05），见表2。

2.3 霉变饲料中添加霉菌毒素复方吸附剂对人工感染肉鸡免疫细胞因子和LTR的影响 与空白对照组相比，饲喂霉变饲料肉鸡血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12含量以及LTR显著降低（P<0.05），人工感染肉鸡血清IL-12含量显著升高、LTR显著降低（P<0.05）。给人工感染肉鸡饲喂霉变饲料与饲喂正常饲料相比，血清IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-12含量以及LTR显著降低（P<0.05）。在人工感染肉鸡采食的霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，肉鸡血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12含量以及LTR显著升高（P<0.05），同时添加抗氧化剂和中药免疫增强剂效果更好，见表3。

2.4 霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对人工感染肉鸡免疫器官指数的影响 与空白对照组相比，饲喂霉变饲料的肉鸡胸腺指数和脾脏指数显著降低（P<0.05），人工感染肉鸡胸腺指数显著降低（P<0.05）。给人工感染肉鸡饲喂霉变饲料与饲喂正常饲料相比，肉鸡胸腺指数和脾脏指数显著降低（P<0.05）。在人工感染肉鸡采食的霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，肉鸡胸腺指数和脾脏指数显著升高（P<0.05），见表4。

2.5 霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对人工感染肉鸡血清中IBDV、H9N1V和NDV抗体水平的影响

2.5.1 霉变饲料中添加霉菌毒素复方吸附剂对人工感染肉鸡血清中IBDV抗体水平的影响 与空白对照组相比，饲喂霉变饲料肉鸡血清IBDV抗体水平显著降低（P<0.05）。给人工感染肉鸡饲喂霉变饲料与饲喂正常饲料相比，血清IBDV抗体水平显著降低（P<0.05）。在人工感染肉鸡采食的霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，鸡血清IBDV抗体水平显著升高（P<0.05），见表5。

2.5.2 霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对人工感染肉鸡血清中H9N1V抗体水平的影响 与空白对照组相比，饲喂霉变饲料肉鸡血清H9N1V抗体水平显著降低（P<0.05）。给人工感染肉鸡饲喂霉变饲料与饲喂正常饲料相比，血清H9N1V抗体水平显著降低（P<0.05）。在人工感染肉鸡采食的霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，肉鸡血清H9N1V抗体水平显著升高（P<0.05），见表6。

2.5.3 霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对人工感染肉鸡血清中NDV抗体水平的影响 与空白对照组相比，饲喂霉变饲料肉鸡血清NDV抗体水平显著降低（P<0.05）。给人工感染肉鸡饲喂霉变饲料与饲喂正常饲料相比，血清NDV抗体水平显著降低（P<0.05）。在人工感染肉鸡采食的霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，肉鸡血清NDV抗体水平显著升高（P<0.05），见表7。

3 讨论

3.1 霉变饲料对肉鸡人工感染发生的影响 试验结果表明，给肉鸡摄入霉变饲料显著降低其日增重、提高料重比和死淘率。与Aravind等[4]的报道一致，肉鸡摄入自然霉变饲料能显著降低平均日增重、采食量和饲料转化率。冯光德等[5]也报道，肉鸭的死亡率随着霉变玉米用量的增加而呈极显著的线性增加。可见，本试验成功建立了肉鸡霉变饲料中毒病例模型。本试验发现，给摄入常规饲料肉鸡接种肉鸡病变组织匀浆液，肉鸡死淘率显著高于空白对照组，死亡肉鸡剖检病理变化符合混合感染的病变特征，成功地建立了肉鸡人工感染疾病模型。在给试验鸡接种肉鸡病变组织匀浆液的情况下，摄入霉变饲料降低平均日增重、提高料重比和死淘率的幅度远高于摄入常规饲料。可见，肉鸡摄入霉变饲料可加重混合感染发生的程度。究其原因，可能与霉菌毒素导致肉鸡抗病力下降有关。本试验也发现，肉鸡摄入霉变饲料其血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12含量以及LTR显著低于空白对照组，胸腺和脾脏指数显著降低，血清IBDV、H9N1V和NDV抗体水平显著降低。徐雪梅等[6]报道，霉变饲料显著降低肉鸡新城疫抗体滴度。何健等[7]研究发现，给肉鸭饲喂自然霉变玉米能显著降低禽流感 H5N1V特异性抗体滴度。汪前红等[8]研究表明，随着日粮中黄曲霉毒素B1含量的增加，肉鸭禽流感疫苗抗体水平显著下降。Okotie等[9]在肉鸡日粮中添加黄曲霉毒素5mg/kg，发现肉鸡的IBDV抗体水平显著下降。由此可见，肉鸡摄入霉变饲料可以加重肉鸡混合感染的发生程度；霉菌毒素导致肉鸡免疫功能抑制、抗病力下降，是导致混合感染肉鸡死亡率升高的重要原因。控制霉菌毒素毒害或减少饲料中霉菌毒素含量，是解决肉鸡混合感染发生发展的重要途径。

3.2 霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂对肉鸡人工感染发生的影响 试验结果表明，给肉鸡摄入的霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，降低肉鸡死淘率；接种肉鸡病变组织匀浆液和摄入霉变饲料的肉鸡死淘率显著高于添加复方霉菌毒素吸附剂。通过观察免疫器官指数、血清细胞因子水平以及IBDV、H9N1V和NDV抗体水平变化，发现霉变饲料中添加复方霉菌毒素吸附剂，可以扭转肉鸡免疫抑制现象，同时添加增强免疫功能的药物，效果更好。李振等[10]也证明在霉变饲料中添加0.2%酵母细胞壁，显著提高IL-6和IFN-γ相对表达量，显著提高NDV抗体水平。Kubena等[11]在含AF 5mg/kg饲粮中添加0.25%的水合硅铝酸纳钙可有效解除AF对肉鸡脾淋巴细胞增殖的抑制，并使胸腺淋巴细胞转化率升高。可见，霉菌毒素吸附剂能有效缓解霉菌毒素导致家禽免疫抑制的不利影响，减轻混合感染的发病程度。

参考文献：

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[11] Kubena L F， Harvey R B， Bailey R H， et al. Effects of a hydrated sodium calcium aluminosilicate （T-Bind）on mycotoxicosis in young broiler chickens[J].Poultry Science，1998，77（10）：1502-1509.