薄皮甜瓜离体再生体系的优化

付秋实等

摘 要： 通过器官发生途径诱导形成不定芽，建立薄皮甜瓜‘IVF05 植株再生体系，探讨不同外植体及不同的激素组合对不定芽再生的影响。结果表明，子叶近胚轴端外植体的不定芽再生率为 90.00%，子叶节的再生率为 85.00 %，子叶远胚轴端外植体的再生率为 31.43%，下胚轴的再生率为 0，子叶近胚轴端是‘IVF05不定芽分化的理想的外植体。不定芽诱导中最适宜的培养基为 MS + ABA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 1.0 mg·L-1，在此培养基上产生的愈伤较少，能正常分化的不定芽较多，不定芽的生长较快。在 MS + 6-BA 0. 05 mg·L-1 的不定芽伸长培养基上，分化的不定芽能够伸长长大。在 MS + IAA 0. 2 mg·L-1 的生根培养基上无根苗容易生根。从外植体培养到获得完整再生植株需 50～60 d。

关键词： 薄皮甜瓜； 离体再生； 子叶； 6-BA； ABA

Abstract： An efficient regeneration system of plantlets was established for melon（Cucumis melo L. ‘IVF05）. We investigated the influence of explant type and plant growth regulator combinations on regeneration rate of adventitious buds in this research. The results showed that the adventitious buds regeneration rates of cotyledon explants near the hypocotyl，cotyledonary nodes，cotyledon explants far from hypocotyl and hypocotyl were 90.00%，85.00%，31.43% and 0，respectively. Cotyledon explants near the hypocotyls were the optimal explants. The optimal concentrations of plant growth regulators were 0.5 mg·L-1 ABA plus 1.0 mg·L-1 6-BA. The buds elongation medium was MS + 6-BA 0.05 mg·L-1. The rooting medium was MS + IAA 0.2 mg·L-1. It took about 50 to 60 days from explants culture to obtain complete regeneration plant.

Key words： Oriental melon； Plant regeneration； Cotyledon； 6-BA； ABA

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的经济作物。随着生活水平的提高，人们越来越重视其产量和品质。近年来随着植物基因工程技术的迅速发展，运用生物技术手段进行种质创新，改良甜瓜品质已经成为甜瓜遗传育种研究的新途径。甜瓜高效再生体系的建立， 对于进一步进行甜瓜功能基因鉴定、转基因等方面的研究十分必要。目前已有通过真叶[1]、子叶[2-5]、下胚轴[6]等多种外植体再生完整植株的报道，但是研究主要集中在厚皮甜瓜上[7-11]，对薄皮甜瓜的研究较少，我国有丰富的薄皮甜瓜种质资源，对薄皮甜瓜的遗传改良具有较大潜力。而且不同的甜瓜品种以及不同生长调节剂组合对甜瓜离体再生体系的建立影响较大，再生潜力依基因型而明显不同[12]。在前人的研究中，采用外植体直接器官发生途径时，一般在培养基中仅添加细胞分裂素或极少量生长素[13-14]。6-BA 作为一种细胞分裂素，在促进细胞分裂和不定芽发生方面具有很好的效果[15-17]。前人以子叶作外植体，6-BA 为主要诱导激素，辅之以 ABA，通过器官直接发生途径，建立了不同基因型黄瓜子叶的再生体系[18-20]。前人在黄瓜上的研究结果表明，6-BA 是不定芽分化所必需的，而 ABA 能明显提高芽的分化速度和不定芽数目。甜瓜也属于葫芦科作物，但是关于 ABA 对甜瓜离体再生的影响还未见报道。因此本文以薄皮甜瓜 ‘IVF05 为材料，研究了不同外植体、不同 6-BA 与 ABA 组合对其离体再生的影响，旨在建立高效的薄皮甜瓜离体再生体系，以期为甜瓜转基因技术以及培育优良的薄皮甜瓜品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为薄皮甜瓜 ‘IVF05，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甜瓜课题组选育。

1.2 方法

2.1 不同外植体对不定芽诱导的影响

外植体的部位是离体培养时的关键因素。3 结论与讨论

外植体的选择是进行组织培养及植株再生的关键。师桂英等[21]研究表明，厚皮甜瓜‘黄河蜜的极性现象不受外植体切割方式和切块大小的影响，而与子叶外植体的切口位置有关，靠近胚轴的切口容易产生不定芽，远离胚轴的切口难以形成不定芽。子叶近胚轴部位的子叶块不定芽的诱导率高于远离胚轴端的子叶块，多数不定芽都是在靠近胚轴端的子叶块中产生。本试验中也表明最适宜作为薄皮甜瓜组织培养的外植体材料为子叶近胚轴端，其不定芽诱导率在 90% 以上。通过子叶近胚轴端直接诱导不定芽途径，成苗时间短，能快速建立起甜瓜的高频稳定再生体系，这与王志强等[22]、陶兴林等[12]试验结果一致。

虽然甜瓜子叶节也有较高不定芽分化率，但前人的研究结果表明，子叶节去除生长点之后，由于生长点周围细胞分裂旺盛，即使未接触芽诱导培养基，仍然会有不定芽的生长[23]。不论是加入还是不加入6-BA，每个子叶节几乎都可以诱导出不定芽，增加6-BA的质量浓度可以增加丛生芽的分化数量。在子叶节基部除不定芽分化外，还有大量丛生畸形叶生长，无生长点，不能进一步培养成正常植株[24]。若在遗传转化选择培养阶段，由于生长点部位不能完全接触选择培养基，此部位分化出的不定芽得到许多假阳性植株，从而加大后续工作量。

6-BA是甜瓜再生分化的关键物质。本试验中不定芽诱导最适6-BA质量浓度为1.0 mg·L-1。在诱导不定芽的增殖生长中，加入较高质量浓度的6-BA，虽然对芽的分化有促进作用，但是容易产生丛芽，同时还发现分化出的丛生芽中存在大量簇生畸形叶（图1-B），无明显生长点，即使进一步培养也不能长成正常植株，并且外植体有黄化现象，这与孙天国等[25]的研究结果一致。因此在继代过程中适当降低细胞分裂素浓度对芽的正常生长是有利的。同时，还应该及时转移分化完全的不定芽至伸长培养基上，避免外植体在含有高浓度激素的芽诱导培养基上停留时间过长。

本试验中 ABA 对甜瓜子叶的芽分化也有促进作用，6-BA和ABA的不同配比影响甜瓜子叶不定芽的分化，不定芽诱导中最适宜的激素组合为MS+ABA 0.5 mg·L-1 +6-BA 1.0 mg·L-1，在此培养基上产生的愈伤较少，能正常分化的不定芽较多并明显伸长，不定芽的生长较快（表2，图1-A）。在只添加2.0 mg·L-1 6-BA的培养基上，外植体表现为轻度黄化（图1-B）。添加ABA是多种难以再生植物组织培养的有效措施，应用到黄瓜组培上也获得相似的结果，以黄瓜子叶作外植体，6-BA为主要诱导激素，辅之以ABA，通过器官直接发生途径，建立了不同基因型黄瓜子叶的再生体系。李泠等[20]报道，ABA在黄瓜再生中起到了重要的作用，与激动素相配合能促进植株分化，并能抑制异常胚状体，促进正常胚状体的发生。梅茜和张兴国[19] 研究也表明，在培养基中添加ABA可明显提高黄瓜的芽再生能力，且以 1.0 mg·L-1 为最适宜，如果不添加ABA，则很难产生不定芽。Sekioka等 [26] 的研究表明在黄瓜的组织培养中，低质量浓度的 ABA（0.1 mg·L-1）促进胚状体的正常发育，而高质量浓度的ABA（1.0 mg·L-1）能显著减少培养物的愈伤组织化，并控制胚状体处于球形胚或球形胚后期。Han等[27] 研究认为，添加ABA可明显提高芽诱导率，6-BA和ABA的组合可适用于不同的黄瓜品种。从激素的影响效应来说，6-BA属于细胞分裂素类，对植物的生长分化起促进作用，而ABA是一种生长抑制剂，可能两者对于维持外植体的激素平衡起到了重要作用，相关机理需进一步作研究。因此，在植物组织培养研究中，选择合适的激素及其配比浓度是获得再生植株的关键。

本试验中将诱导的不定芽转入伸长培养基中（MS + 6-BA 0.05 mg·L-1），分化的不定芽能够伸长长大，在生根培养基中（MS + IAA 0.2 mg·L-1） 容易生根。从外植体培养到获得完整再生植株需 50～60 d，建立了薄皮甜瓜遗传转化和快繁的子叶再生体系。

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