125I体外照射联合C225诱导MNK—45细胞凋亡及对Bcl—2和Bax表达的影响

李逊 李巍伟 陈明媚等

摘要：目的 探讨125I粒子连续体外照射联合表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂（C225）对人胃癌细胞（MNK-45）的促凋亡作用及对凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响，初步了解二者联合治疗胃癌的相关机制。方法 体外培养人胃癌细胞。实验共分对照组、单药组、单照组、联合组。单药组与联合组细胞预先经2000μg/ml C225处理。选取放射活度14.49MBq的125I粒子建立体外照射装置，对单照组和联合组细胞进行持续照射，对照组与单药组细胞则置于相同装置中但未接受125I粒子照射。72h后收集各组细胞，用细胞计数法观察分析细胞生长情况。流式细胞术检测细胞凋亡率。RT-PCR检测细胞Bcl-2和BaxmRNA的表达。 结果 各实验组细胞增殖均较对照组明显受抑，倍增时间延长，差异均有显著性（P<0.05）。各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加，差异均有显著性（P<0.05），且联合组细胞凋亡率较单照组与单药组均明显增加，差异有显著性（P<0.05）。RT-PCR检测显示各实验组较对照组均有不同程度的Bax表达增加、Bcl-2表达减弱以及Bax/Bcl-2比值增加，差异有显著性（P<0.05），且分别与单药组和单照组比较，联合组细胞上述表现最为明显（P<0.05）。结论 125I粒子体外照射联合C225可显著强化对人胃癌细胞MNK-45的凋亡诱导效应；其机制可能与二者协同下调Bcl-2，上调Bax表达，进一步提高Bax/Bcl-2比值有关。

关键词：125I粒子；表皮生长因子受体抑制剂；人胃癌细胞；凋亡；Bcl-2；Bax

125I粒子永久组织间植入作为一种微创放射治疗手段，目前已被广泛运用于不同分期及病理类型胃癌的临床治疗并获得良好效果[1-3]。表皮生长因子受体（EGFR）因其明确的恶性生物学特性而成为肿瘤治疗的重要靶点。EGFR抑制剂西妥昔单抗（C225）为近年来研发的一种针对EGFR的高效分子靶向药物，现已被用于多种肿瘤的临床辅助治疗。本实验通过125I粒子外照射联合C225作用于人胃癌细胞MNK-45，观察其对细胞的凋亡诱导效应，并对Bcl-2及Bax表达情况进行量化分析，旨在初步探讨二者联合的抗胃癌机制，为临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1试剂与仪器 注射用C225（100mg/50ml/瓶））由德国Boehringer公司生产；人胃癌细胞株MNK-45（EGFR高表达系）购自南京凯基生物科技发展有限公司；125I粒子（放射性活度14.49MBq）购自上海欣科医药公司；高糖型（DMEM）培养液为美国Hyclone公司产品；青链双抗为Hyclone公司产品；胎牛血清购为乌拉圭GIBCO公司产品；β肌动蛋白（β-actin）、 （Bcl-2）和（Bax）基因PCR引物均由由上海生物工程技术服务有限公司合成，基因片段扩增的引物序列见表1。（ABI）实时定量荧光PCR仪购自美国 ABI公司。流式细胞仪购自美国BECKMAN COULTER公司，显微拍摄系统为日本NIKON公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养及标本制作 含10%胎牛血清的DMEM培养液培养MNK-45细胞，将其置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中，2～3d传代1次。取对数生长期细胞，以3×106/ml的浓度接种于直径为35mm的培养皿中，共接种16个皿，每皿约有3ml细胞悬液。24h后（待细胞贴壁、稳定）用于实验。

1.2.2建立外放射模型 根据曼彻斯特系统布源原理，将放射活度为14.49MBq型125I粒子9粒，依据Meredith设计的近距离照射治疗体外细胞试验布源系统制作模型（图1）。根据美国医用物理学家协会（AAPM） 发布的放射剂量计算公式得出该125I粒子外放射模型72h放射总剂量约为113cGy。

1.2.3实验分组 实验共分四组，对照组、单照组、单药组、联合组。每组4个培养皿，单药组与联合组预先加入2000μg/ml C225约0.35ml，使培养皿内C225浓度达到约200μg/ml（参考C225稳态血药浓度均值）。对照组和单照组则加入等量培养基。将四组细胞置入照射模型，其中单照组与联合组接受125I粒子照射，对照组与单药组则不接受照射，72h后收集细胞。

1.2.4细胞增殖检测 72h后，取对照组和3个实验组分别进行细胞计数。根据细胞计数结果，以培养皿单位细胞数（细胞数/ml）为纵坐标，观察时间为横坐标绘制生长曲线。根据Patterson公式计算细胞群体倍增时间（doubling time，TD）：TD=T×log2/（logNt-logN0），其中N0为初始细胞数，Nt为终末细胞数，T为Nt～N0的时间。然后进行对比和统计学分析。

1.2.5常规流式细胞法（FCM）碘化丙啶（PI）染色检测细胞凋亡 取培养皿细胞，弃培养液，以磷酸盐缓冲液洗涤，0.25%胰酶消化，PBS缓冲液吹打收集制成细胞悬液，调整细胞浓度至1×106/ml，2000r/min离心、重悬，去上清液；沉淀物PBS洗涤2次，加入DNA-PREP试剂盒中的核糖核酸酶200μl，避光保存15min，然后加入PI 1000μl，避光保存15min，上機检测。

1.2.6半定量RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达 内参β-actin上游引物为5'-AAGGCCAACCGCGAGAA-3'，下游引物为5'- CCTCGTAGATGGGCACA-3'，扩增片段长度为176bp；Bax上游引物为5'-GGATGATTGCCGCCGT-3'，下游引物为5'-CCCAGTTGAAGTTGCCGT-3'，扩为增片段长度92bp：Bcl-2上游引物为5'-ACAGAGAACCATCCCTATT-3'，下游引物为5'-GAGAGAATGTTGGCGTCTT-3'，扩增片段长度为321bp。TRIzol法提取各组细胞总RNA，每个样本等量取总RNA5μg，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增条件：预变性94℃3 rnin，此后变性90℃45s，退火57℃45s，延伸72℃1 min，共35个循环。结果分析：产物行琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶图像处理系统得出目的基因及内参灰度值，以内参为标准对比进行半定量分析。

1.3统计学处理 数据资料采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计量结果用均数±标准差（x±s）表示；采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同处理对细胞增殖的影响72h后，各组细胞数量分别为对照组（15.74±0.67）×106/ml、单放组（6.27±0.91）×106/ml、单药组（8.27±1.06）×106/ml、联合组（4.57±0.29）×106/ml。各实验组细胞数量均明显减少，较对照组细胞数总体差异均有统计学意义（P<0.05）；各组细胞生长倍增时间分别为对照组（0.76±0.12）、单照组（1.92±0.43）、单药组（1.68±0.21）、联合组（2.47±0.19），各实验组细胞倍增时间延长，较对照组细胞生长倍增时间总体差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2不同处理对细胞凋亡率的影响 检测结果显示各处理组细胞凋亡率较对照组均明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05），且联合组细胞凋亡率均明显高于单照组与单药组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3不同处理组中细胞Bax 和Bcl-2的表達变化 各实验组细胞均较对照组出现Bax mRNA表达增加，Bcl-2mRNA表达减弱以及Bax/Bcl-2比值提高（P<0.05）。此效应在联合组表现尤为显著，明显强于单照组与单药组（P<0.05），见表3。

3 讨论

125I粒子为一种低剂量率的微型放射源，在衰变过程中可同时释放X线和γ射线，临床上可将其以不同方式植入肿瘤组织、瘤旁组织、淋巴转移途径等部位以治疗不同分期的各类恶性肿瘤，能够在较长的半衰期内（60.1d）对癌细胞进行持续杀伤，相比于传统体外放射治疗，125I粒子具有精度高，创伤小，射线杀伤半径适当等优点[4]。已知的研究结果表明，低剂量率辐射引发肿瘤细胞损伤可导致其出现两种死亡形式，即坏死性死亡及凋亡，其中凋亡占主导地位[5]。何启明等[6]报道，胃癌细胞经125I粒子照射后出现大量凋亡，且Bcl-2与Bax的表达均有所改变，Bcl-2/Bax比值降低，本实验结果与之相符，因此认为通过调控凋亡相关基因的表达诱导凋亡是125I粒子抗肿瘤的重要作用机制。

EGFR是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的跨膜多功能糖蛋白，在多数上皮源性肿瘤中呈过度表达与活化状态。它通过与相应配体包括表皮生长因子、转化生长因子和肝素结合表皮生长因子等结合后发生自体磷酸化而被激活，进而激发细胞内多条信号转导通路促进肿瘤细胞分裂、迁徙以及肿瘤新生血管的形成[7]。此外，癌细胞在接受高强度射线刺激后，会出现EGFR反应性再表达，直接致使照射后残存癌细胞放射抗拒的提升，一方面导致后续辐射治疗效果减弱，另一方面使得残存癌细胞转移与增殖能力增强。因此，通过阻滞和下调EGFR抑制肿瘤细胞的无序生长以及改善放疗预后是很有价值的策略。C225对于EGFR高表达的结直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌均有较为明确的疗效。

Bcl-2是目前备受重视的调控细胞凋亡的基因家族，共分为两大类，一类是抑制凋亡基因如Bcl-2，另一类是促进凋亡基因，如Bax。特殊情况下细胞内Bcl-2/Bax的相对固定比例被打破，细胞凋亡程度即受到改变。若Bax表达占优势，则Bcl-2被抑制，凋亡被诱导；反之若Bax表达受抑制，则细胞得以存活。

基于上述理论，笔者认为125I粒子低剂量率持续照射同时联合C225阻断EGFR可更有效地发挥抗胃癌作用。一方面，持续照射在较长时间内保证了与C225的协同作用，避免了普通外放射与该药联用时的给药时机问题；另一方面，C225单独作用的同时降低肿瘤细胞的辐射抗性，提高了粒子照射的治疗效率。本实验证实了这一观点，细胞增殖及细胞凋亡检测发现各实验组MNK-45细胞较对照组均出现明显生长缓慢及凋亡率增加的现象，其中又以联合作用组此效应体现得最为显著。值得一提的是，联合作用时引起的细胞凋亡率大于单纯照射与单纯药物所引起的凋亡率之和。说明不但C225本身可以引起MNK-45细胞的凋亡，而且促进了125I粒子照射下MNK-45细胞凋亡 。

由上可见，临床上行125I粒子植入治疗胃癌时，可以考虑与C225联合应用，以增强治疗效果。但目前关于二者联合时对正常组织的毒性机制以及细胞敏感性预测因子的相关研究尚缺乏，故使用仍需慎重。因此，该疗法的临床应用意义仍需在动物试验及临床实验中进一步证实。

参考文献：

[1]卜延志，徐月华，戴旭东.125I粒子术中植入与腹腔内化疗联合应用治疗胃癌疗效观察[J].中国医学研究与临床，2006，4（6）：50-51.

[2]毛文源，罗开元，邵庆华，等. 125I粒子近距离组织间放射治疗胃癌[J].中华胃肠外科杂志，2002，5（2）：112-114.

[3]邵庆华，罗开元，杨镛，等.胃肠道恶性肿瘤根治术中125碘放射性粒子近距离治疗疗效观察[J].中国实用外科杂志，2002，22（9）：541-542.

[4]罗开元.实用组织间植入内放射治疗恶性肿瘤学[M]. .1版.北京： 人民卫生出版社， 2008：9-16.

[5]何启明，伍晓汀. 125I籽源持续照射诱发胃癌细胞株MKN-45凋亡的实验研究[J].四川大学学报，2009，40（3）：454-458.

[6]Herbst RS. Review of epidermal growth factor receptor biology[J]. Int J Oncol Biol Phys，2004， 59（2）： 21-26.

[7]钱军，秦叔逵.以表皮生长因子受体为靶点的抗癌新药-C225[J].中国实用内科杂志，2005，25（8） ：676-678.编辑/哈涛