西瓜花叶病毒对四倍体西瓜叶片细胞超微结构的影响

朱红菊 路绪强 刘文革 赵胜杰 阎志红 何楠 豆峻岭 高磊

摘 要： 为研究西瓜花叶病毒（WMV）对四倍体西瓜功能叶片细胞超微结构的影响，用透射电镜观察四倍体西瓜受WMV侵染后功能叶片细胞超微结构的变化。结果表明，WMV侵染四倍体西瓜后，四倍体西瓜叶片细胞叶绿体肿胀、片层模糊不清、叶绿体外膜产生异形增生物等；细胞内嗜锇颗粒增加，有大量的风轮状内含体出现，产生大量的束丝包裹病毒粒子；有高尔基体出现，线粒体数目增加，细胞核核膜部分边缘被破坏，核仁融解等。与正常四倍体西瓜叶片细胞相比，WMV对四倍体西瓜叶片细胞超微结构破坏严重，影响四倍体西瓜正常生长。

关键词： 西瓜花叶病毒； 叶片细胞； 超微结构

Effect of WMV on the Ultrastructure of Tetraploid Watermelon Leaves

ZHU Hong-ju， LU Xu-qiang， LIU Wen-ge， ZHAO Sheng-jie， YAN Zhi-hong， HE Nan， DOU Jun-ling， GAO Lei

（Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS， Zhengzhou， Henan 450009， China）

Abstract： Effect of WMV infection on leaf cell ultrastructure of tetraploid watermelon was examined by transmission election microscopy. When plant of watermelon were infected by WMV，the altrastructure alteration of leaf cell was obvious，chloroplast showed severe swellness，looseness of grana，heterogeneous puffiness on the chloroplast membrane，more osmiophilic globules，more pinwheel inclusion，more cytoplasmic strand，Golgi apparatus appeared，more mitochondria，disintegration of nucleous membrane and disintegration of nucleus. The growth of tetraploid watermelon was also affected by WMV compared with control.

Key words： WMV； Leaf cell； Ultrastructure

四倍体西瓜具有种子少、果肉含糖量高、风味好、植株分枝力弱、抗性强、管理方便等特点，生产上常用其做母本与二倍体西瓜杂交产生无籽果实[1-3]。在实际生产中无籽西瓜和四倍体西瓜容易感染病毒病，给育种和生产带了很大的障碍。病毒病是西瓜主要病害之一，西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus，WMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，1954年Anderson等人[4]首次在西瓜上发现该病毒，WMV是造成西瓜病毒病的一个主要毒源。在田间，WMV主要由蚜虫传播，在夏季，高温、干旱、光照充足，造成蚜虫繁殖快，数量多。当蚜虫成群的聚集在瓜叶上吸取汁液，当它吸食感病植株病汁液，再迁飞到无病植株上，就可以在短时间内迅速完成病毒传播，导致植株营养不良。近年来，随着夏季干旱的加剧，西瓜花叶病毒病在西瓜主产区内均有发生，并且呈上升趋势，WMV侵染西瓜，早期感病会造成不结瓜或畸形瓜，对产量影响很大；坐瓜期感病，则降低瓜的品质[5]，因此是制约西瓜稳产高产优质的重要因素之一。WMV粒子主要存在于表皮和叶肉细胞的细胞质中，受侵染的植株细胞膜受到严重的破坏，并且叶绿体、线粒体结构受损，尤其是叶绿体，由于基粒片层的崩解，叶绿素大量解体，使得寄主组织出现褪绿的现象[6]。国内外研究者对西瓜花叶病毒的生物学特性、抗病资源、抗病毒基因工程策略等方面进行了较多的研究[7-11]，刘文革等[12]和朱红菊等[13]对西瓜叶片的表皮形态和超微结构进行了观察，但是对西瓜花叶病毒侵染西瓜叶片后的超微结构尚未见报道。本研究通过观察四倍体西瓜叶片细胞感染WMV之后的超微结构，为无籽西瓜育种和生产提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试四倍体西瓜材料为秋水仙素诱导加倍后的西瓜四倍体（4B32），于2010 年在中牟实验基地种植。待西瓜植株盛花期时，选择感染WMV发病较重的四倍体西瓜作为切片的试验材料，对照材料选择相同位置正常生长四倍体西瓜的功能叶片切片。

1.2 试验方法

沿叶片主叶脉在两份材料相同部位剪取2 mm×2 mm的叶样，将剪下的材料立即放入盛有预冷的4%戊二醛固定液中，抽真空，在0~4 ℃下固定24 h；取出固定好的材料，用0.1 mol·L-1PBS（pH7.2）清洗3次，每次20 min；用1% 锇酸固定3 h，用0.1 mol·L-1PBS清洗3次，每次20 min；不同体积分数的乙醇逐级脱水：30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇（每级15 min）→100%乙醇→100%乙醇（无水乙醇每级30 min）；用无水丙酮置换3次，每次15 min；丙酮以2∶1比例配制的混合浸透液，35 ℃温箱，浸透2 h；Epon812环氧树脂包埋；LKB5型切片机切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色；于HITACHI-H7500型透射电镜下对叶片细胞超微结构进行观察并拍照（透射电镜的试验是在中国农业科学院农产品加工研究所完成的）。观察正常生长的四倍体西瓜叶片及受WMV感染的四倍体西瓜叶片细胞中叶绿体、叶绿体基粒片层、线粒体、细胞核、高尔基体等细胞结构，每个样品观察10个以上视野。

2 结果与分析

2.1 正常四倍体西瓜叶片细胞超微结构形态特征

从图1中可以看出正常生长的四倍体西瓜叶片细胞形态特征为：线粒体、叶绿体形态清晰，结构规整，叶绿体呈现梭形，整齐地排列在细胞膜边缘（图1-a），其上基质类囊体、基粒类囊体排列规则（图1-b、c），结构清晰，液泡显著，核染色质致密、均匀，核膜平滑、清晰，核仁浓黑（图1-d），显示叶片光合作用旺盛、各类代谢通畅。

2.2 感染WMV之后的四倍体西瓜叶片细胞形态特征

从图1中可以看出，四倍体西瓜叶片感染WMV之后，叶片细胞结构发生的变化有：叶绿体肿胀变圆，片层模糊不清，叶绿体脱离细胞膜周边，游离到细胞质中（图1-e），部分叶绿体边缘出现异性增生物（图1-f）；线粒体和嗜锇颗粒数目增加（图1-g）；在内质网上有大量的风轮状内含体出现（图1-h）；细胞质中出现高尔基体（图1-i）；产生大量的束丝包裹病毒粒子（图1-j）；细胞核核膜部分边缘被破坏，核仁融解（图1-k）。

图1 正常四倍体西瓜和WMV侵染后四倍体西瓜叶片超微结构

a. 正常四倍体西瓜叶肉细胞（×4 000）； b. 正常四倍体西瓜叶肉细胞叶绿体（×30 000）； c. 正常四倍体西瓜叶肉细胞叶绿体上的片层（×60 000）； d. 正常四倍体西瓜叶肉细胞细胞核（×15 000）； e. WMV侵染的四倍体西瓜叶肉细胞叶绿体游离到细胞中（×6 000）； f. WMV侵染的四倍体西瓜叶肉细胞叶绿体外膜增生（×30 000）； g. WMV侵染的四倍体西瓜叶肉细胞增多的线粒体（×60 000）； h. WMV侵染的四倍体西瓜叶肉细胞风轮状内含体（×50 000）； i. WMV侵染的四倍体西瓜叶肉细胞内的高尔基体（×80 000）； j. WMV侵染的四倍体西瓜叶肉细胞细胞质束丝（×30 000）； k. WMV侵染的四倍体西瓜叶肉细胞部分核膜降解， 核仁消失（×30 000）。CW 细胞壁； CH 叶绿体； N 细胞核； NL 核仁； M 线粒体； PW 风轮状内含体； CS 细胞质束丝； G高尔基体。

3 讨论与结论

朱红菊等[11]研究发现，正常生长的四倍体西瓜叶片细胞线粒体、叶绿体形态清晰，结构规整。叶绿体呈现梭形，整齐地排列在细胞膜边缘，其上基质类囊体、基粒类囊体排列规则，结构清晰，液泡显著。核染色质致密、均匀，核膜平滑、清晰，核仁浓黑。植物在遇到病毒侵染时，叶片细胞超微结构会受到损伤，其中对病毒侵染最敏感的细胞器是叶绿体，病毒侵染后叶绿体会由正常的梭形膨胀变圆、基粒片层松散、模糊不清、叶绿体膜降解、脱离细胞膜周边甚至游离到细胞质中等现象[14]，这些现象在本研究中也都有发现。

智海剑等[14]和李赤等[15]都认为结构遭到破坏、处于解体状态下的叶绿体会出现嗜锇颗粒数量增加的现象，这种情况经常发生在衰老和生病的叶细胞中，嗜锇颗粒是叶绿体膜结构的降解产物—脂类发生集结的结果。正常生长发育的叶绿体内，就很少存在嗜锇颗粒。在本研究中，四倍体西瓜叶片经WMV感染之后，叶绿体内出现了大量嗜锇颗粒，正常的光合作用无法进行，影响植物的生长，使植物呈现病态。

李学湛[16]研究病毒感染对大豆叶片细胞超微结构的影响发现，病毒侵染宿主之后，在寄主叶片细胞中首先出现风轮状内含体，之后出现病毒粒体，这些粒体逐渐被液泡膜形成的束丝包裹起来，附着在叶绿体上。这些风轮状内含体可能是SMV 粒体的RNA作用转译RNA多聚酶所合成的细胞代谢抑制物，不但抑制了细胞的代谢，又旋转破坏了细胞内的正常结构。因此本研究发现的风轮状的内含体应该是病毒刚开始入侵的时期，而液泡膜形成的束丝状体则是侵染后期包裹病毒的内含体。Tresnaputra U S和Ehara Y[17]研究发现大豆感染SMV后，细胞质内出现风轮状内含体及无定形体，并且这些内含体的数量与植株的抗病能力密切相关。滕卫丽等[18]研究大豆感染SMV之后感病品种细胞内出现了风轮状内含体，而抗病品种细胞内则没有出现这种内含体。由此可见风轮状内含体是四倍体西瓜感染了WMV之后出现的破坏细胞结构的物质。

正常生长的四倍体西瓜叶片细胞中是观察不到高尔基体的，但是当四倍体西瓜感染WMV之后细胞质内出现了高尔基体。生物细胞中的高尔基体有其独特的作用，它有转运细胞内糖、类脂化合物的作用，并且参与合成溶酶体[17]，因此，本研究中高尔基体的出现是寄主细胞抵抗病原体侵入的一种抗性反应。

李文龙等[19]发现大豆受SMV侵染后细胞核核膜降解，景炳年等[20]发现烟草受VFB侵染后出现了细胞核核膜的破裂，认为这是细胞核膜为了加强抗病机制、处于应激代偿或失代偿状态所致。本研究也发现正常生长的叶片细胞膜核膜清晰完整，而被WMV侵染后细胞膜核膜发生破裂，这可能与四倍体西瓜细胞的抗病响应机制相关。本文只对四倍体西瓜叶被WMV侵染后的超微结构进行分析，具体与二倍体西瓜相比较，其抗病毒的机制如何，还需要进一步研究。

本文通过比较正常生长的四倍体西瓜叶片细胞和受到WMV侵染的四倍体西瓜叶片细胞的超微结构发现，受到WMV侵染后，细胞膜、叶绿体、线粒体、高尔基体、细胞核等细胞结构均受到了影响，细胞功能受到损伤，影响西瓜植株的正常生长。

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收稿日期： 2013-11-05； 修回日期： 2014-03-25

基金项目： 国家自然科学基金（31171979）； 现代农业产业技术体系建设专项（CARS-26-03）； “十二五”国家科技支撑项目（2012BAD02B00）

作者简介： 朱红菊，女，硕士。电话： 15903610524； 电子信箱： huanpei633@163.com

通信作者： 刘文革，男，博士，研究员，博士研究生导师，全国无籽西瓜科研与生产协作组组长，国家西甜瓜产业技术体系无籽西瓜育种岗位科学家，主要从事西瓜多倍体育种与生物技术研究。电话： 0371-65330936； 电子信箱： lwgwm@163.com