瓜类及蔬菜等植物病原细菌抗铜机制研究进展

李强 杨玉文 孙柏欣 王铁霖 赵廷昌 胡俊

摘 要： 铜素杀菌剂是一类主要用于防治细菌性病害的杀菌剂，特别是防治瓜类细菌性果斑病的主要杀菌剂，然而由于此类杀菌剂的广泛使用，使细菌的耐药性随之增强。对近几年阐述较为清晰的几种细菌的抗铜机制进行概述，主要包括Cop系统、Cut系统、Pco系统、Cus系统、P型ATP酶排出系统、非ATP酶排出系统和多聚磷酸盐参与的铜外排系统，旨在为瓜类细菌性果斑病抗铜机制研究和科学使用铜素杀菌剂提供参考。

关键词： 瓜类细菌性果斑病； 杀菌剂； 抗铜机制

Advances in Copper Resistant Mechanisms of Cucurbit and Vegetable Pathogenic Bacteria

LI Qiang1，2， YANG Yu-wen2， SUN Bai-xin2， WANG Tie-lin2， ZHAO Ting-chang2， HU Jun1

（1. College of Agronomy， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China； 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： Copper is a bactericide used for preventing bacterial diseases, especially in the prevention of watermelon bacterial fruit blotch（BFB）. However，wide use of copper chemicals has enhanced bacteria to develop tolerance to copper. The research of copper tolerance genes and mechanism of copper tolerance in bacteria are summarized in this paper. We mainly describe cop system，cut system，pco system，cus system，P type ATPase removal system，non-P type ATPase removal system and polyphosphates removal system in this article. We want to provide references for further study of copper tolerance mechanisms of BFB and the rationale of proper use of copper bactericides.

Key words： Bacterial Fruit Blotch； Bactericides； Copper tolerance mechanisms

铜是细菌维持正常新陈代谢所必需的元素，微量的铜是细菌中一些酶不可或缺的成分，如细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶和赖氨酸氧化酶等。但是，当铜浓度过高时，会对细菌产生毒害作用，因为铜能参与细胞生化反应产生活性氧簇，破坏细胞内的金属键与金属平衡，它还能与生物大分子如蛋白质等结合，影响其正常的生理功能及活性[1]。因此，利用铜对细菌的毒害作用，研制出了铜素杀菌剂。铜素杀菌剂在农业生产中是一类重要的杀菌剂，随着该类杀菌剂的广泛使用，特别是由于一些耐铜菌株的出现[2]，导致铜素杀菌剂的用量随之提高，但铜属于重金属元素，长期大量使用会积聚于土壤中，破坏土壤微生物群落的生态环境，使农作物产生药害，危害人类健康[3-5]。而瓜类和蔬菜对许多药剂敏感，更加容易发生药害，尤其是苗期抗药力弱，用药应十分慎重。

细菌在长期进化中形成了多种机制来抵抗重金属离子的毒害，人们对细菌的抗铜机制进行了大量深入的研究，提出了各种解释。本文主要从细菌对铜的隔离沉积和排出的角度作简要论述，为深入研究细菌的抗铜机制提供参考和借鉴。

1 隔离沉积模式

隔离沉积模式是细胞通过表达能与铜结合的蛋白并且将结合的螯合物转运到一个对细胞没有毒害的位置，目前Cop系统是细菌通过隔离沉积避免铜毒害的典型模式。

1.1 Cop系统

最早的Cop系统是在Pseudomonas syringaepv. tomato中发现的。该系统涉及到的6个基因，分别为 CopA、CopB、CopC、CopD、CopR和CopS，其中CopA、CopB、CopC和CopD为结构基因，CopR和CopS为调节基因[5-7]。他们所对应的功能蛋白中，CopA和CopB是抗铜所必需的蛋白，负责铜的转运，CopC和CopD协助CopA和CopB行使抗铜功能。CopA和CopC是细胞周质蛋白，能与铜螯合，与铜结合的化学计量比分别为1 ∶ 11和1 ∶ 1（多肽 ∶ Cu原子），CopA含有丰富的组氨酸，组氨酸的含量决定细菌抗铜性的高低，并且CopA有与铜离子结合的基本序列Met-X2-Met-X-His-X2-Met。CopC是一个桶状结构，含有Cu+和Cu2+结合位点[6-7]。CopB是一个外膜蛋白，有5个8肽序列Asp-His-X2-Met-X2-Met，这一序列也是铜离子结合位点[8]。CopD为内膜蛋白，包含几个保守的组氨酸和几个跨膜区，其功能是负责铜的运输。Cop系统的调节是由CopR和CopS实现的，CopS是传感蛋白，位于细胞膜上，CopR是激活蛋白，可与DNA结合。CopR和CopS调节系统是典型的磷酸转移双组分系统。CopS感受外界铜离子的浓度变化，当浓度超过生理需求时，CopS与铜离子结合，同时水解ATP，被磷酸化。被磷酸化的CopS结合在CopR上，激活CopR，使转录发生。

2 非ATP酶排出模式

非ATP酶排出模式与ATP酶排出模式的主要区别在于前者是质粒基因编码的蛋白，该蛋白充当载体将重金属铜离子通过传递运输排出到细胞外。该模式3种系统（Cut系统、Pco系统和Cus系统）的抗铜机制基本相似。

2.1 Cut系统

Cut系统和Pco系统主要在Escherichia coil中研究的比较多。涉及到的8个基因，分别为：CutA、CutB、CutC、CutD、CutE、CutF、CutR和CutS。其中CutA、CutB、CutC、CutD、CutE和CutF为结构基因，CutR和CutS为调节基因[9-10]。CutA和CutB是细胞内膜蛋白，参与铜的吸收，CutC为细胞质蛋白，在细胞质内参与铜外排的传递，CutD为周质蛋白，相当于铜外排的载体。CutC和CutD协同参与铜的排放，CutE为铜结合蛋白，参与细胞内的的铜结合；而CutF参与铜的运输，将铜传递至某些酶上的铜结合位点[11]。Cut系统的调节和Cop系统的调节类似，由CutR和CutS组成的磷酸转移双组分系统共同调节完成（图1）。

2.2 Pco系统

Pco系统由PcoA、PcoB、PcoC、PcoD、PcoE、PcoR和PcoS构成，其中PcoA、PcoB、PcoC、PcoD和PcoE为结构基因，PcoR和PcoS为调节基因[12]。PcoA为细胞内膜蛋白，与多铜氧化酶的功能类似，含有Arg-Arg基序，可以通过TAT通路将多余的铜从细胞质转运到周质空间[13-15]。PcoB也为细胞内膜蛋白，目前认为PcoB可能和PcoA协同将铜离子运到细胞周质。PcoC为细胞质内的金属蛋白酶，可以与铜离子结合，参与细胞质内铜离子的传递[16]。PcoD为内膜蛋白，含有8个跨膜区，负责铜的转运[17]。PcoE为周质蛋白，具体功能还不清楚。PcoR、PcoS与CopR、CopS的调节机制基本相同，不同的是在PcoR和PcoS同时缺失时，CutR和CutS可代替它们行使该功能，同时调节其他与抗铜相关基因的表达。最初这一系统被称为PcoARBC，后来发现，PcoARBC与P. syringae的CopABCD非常相似，因此重新命名为PcoABCD，调节基因PcoR和PcoS位于PcoABCD的后面，后来又发现了PcoE，构成了PcoABCDRSE。其中，PcoABCDRS与P. Syringae的CopABCDRS有氨基酸同源性很高（图 2）。

2.3 Cus系统

Cus系统由CusC、CusF、CusB、CusA、CusR和CusS构成，CusC、CusB和CusA编码的蛋白组成铜的外排泵，属于Resistance nodulation cell division（RND）家族。CusF属于细胞周质蛋白，有一个固定的铜结合位点，结合多余的铜并将其运输到CusCBA外排泵上，进而将铜排出到细胞外[18]。2009年，Su等[19]报道了大肠杆菌的CusB晶体结构，该结构可结合铜离子，并通过实验证实CusB能识别并运出铜。CusR和CusS编码双组分调控系统：CusS是位于细胞膜上的组氨酸蛋白激酶，其作用是感应周质空间中的铜离子浓度；CusR作为响应调节因子，激活CusCFBA的转录。

3 P型ATP酶排出模式

P型ATP酶是一个转运家族，负责金属的转运和排出。P型铜转运ATP酶基因由染色体上的抗铜基因编码[20]，此酶含有一个保守的CPx-（x=C，H，或S）基序[21]，促进铜离子的转运和排出并伴随ATP水解。

在Pseudomonas putida中有4个编码P型ATP酶的基因，这4个基因都有磷酸化作用所必须的保守碱基，与一价金属离子和二价金属离子的转运和外排有关[22]。P. putida的抗铜系统也是受一个双组分系统调节，该系统由1个阳离子反向转运体和2个金属结合蛋白组成。在Enterococcus hirae中，eCopA和eCopB也属于P型ATP酶，eCopA负责铜的转运，eCopB负责铜的排出[23-24]。在Acidithiobacillus ferrooxidans中，也存在2个编码铜转运的P型ATPase的基因，分别为afCopA和afCopB[25]（afCopA和afCopB与P. syringae中质粒编码的CopA和CopB名称相同，但结构和功能不同），进一步分析得到，afcopA存在两个拷贝，即afcopA1和afcopA2，而其中只有一个基因编码P型ATPase，这可能是A. ferrooxidans抗铜能力比E. Coil强的原因之一。afcopA1在E. coil中表达后使大肠杆菌的铜抗性增强，这表明afcopA1可能是A. ferrooxidans的一个功能性抗铜基因[26]。而且，在A. Ferrooxidans的生长过程中加入铜离子后，afcopB出现过表达现象，如果将afcopB在E. coil中成功表达后，能够使其获得更高的抗铜能力[26]。他们进一步研究发现，afCopB与其他已被鉴定的负责转运铜的蛋白有特征性同源序列，所以我们推测afCopB也是一个转运铜的蛋白。2008年，Luo等[27]研究发现， A. ferrooxidans在铜离子存在时afcopA2的表达量比afcopA1高，推测afcopA2可能在铜胁迫应答过程中发挥更为重要的作用。2013年赵文龙[28]发现在Acidovorax citrulli中与重金属转移相关的P型ATP酶基因有4个，编号分别为：Aave-0034、Aave-0356、Aave-1521和Aave-1815，其中与铜转运较为密切的基因是Aave-0034。

在E. coil中，P型ATPase的表达是由ATPase、多铜氧化酶以及转录调控子CueR共同组成的Cue系统完成[29]。Outten等[30]对E. coil的P型ATP酶基因和多铜氧化酶基因（CueO）的启动子进行了分析，从中找到了在铜离子存在时与CueR结合的序列，该序列与铜离子结合促进Cue系统的完成。在A. ferrooxidans中没有找到与铜离子结合的CueR序列，这表明在A. ferrooxidans中可能存在不同的抗铜调控系统。在Enterococus中，外排ATPase的表达也是受eCopYZ基因组成的双组分系统调控调节的，eCopY基因编码阻遏物蛋白，当Cu结合到eCopZ时，eCopY就被释放[23-24]。

4 多聚磷酸盐参与的铜外排系统

多聚磷酸盐是由正磷酸盐通过磷酸酐键连接而成的线状多聚物，它的合成是在多聚磷酸盐激酶（PPK）的催化下，将ATP的末端磷酸转移到多聚磷酸盐链末端，而多聚磷酸盐外切酶（PPX）可以将多聚磷酸盐水解为无机磷酸盐[31]。多聚磷酸盐有许多生理功能，可以作为ATP的来源、细胞质内的磷酸盐库、金属离子的螯合剂，并可以缓和细胞内的金属压力[32]。2003年，Vera等[33]已经在A. ferrooxidans中发现编码PPK和PPX的这两种酶的基因序列高度保守。

在Acidithiobacillus spp.中，多聚磷酸盐充当能量的媒介物来源参与铜的外排 [31]。2004年，Alvarez和Jerez[34]在利用透射电镜研究A. ferrooxidans时发现了由多聚磷酸盐组成的电子致密颗粒。同时，在A. thiooxidans和嗜酸性的古菌Sulfolobus metallicus中也发现了多聚磷酸盐颗粒。在研究铜和细胞内多聚磷酸盐的关系之后发现A. ferrooxidans在铜离子浓度较高的条件下培养时，细胞内的多聚磷酸盐水平比在正常条件培养时低很多，同时多聚磷酸盐外切酶活性较正常条件时有所提高，于是可以得出结论：抗铜能力比较强的菌株，其细胞内的多聚磷酸盐水平较高；在较高铜离子浓度的条件下能够提高A. ferrooxidans中的PPX的活性，将多聚磷酸盐分解成无机磷酸盐单体，无机磷酸盐单体可以结合细胞质中多余的金属离子，这些金属磷酸盐复合物通过转运蛋白排出到细胞外部；同时多聚磷酸盐水解会释放大量的能量，合成的ATP用于金属磷酸盐复合物的外排[35]。

5 研究展望

细菌细胞内铜浓度升高时，不是单一基因或者机制响应该变化，而是由一套分工细致、紧密协调的体系响应该变化，从而将多余的铜从细胞质和细胞周质中清除，减少其对细菌的毒害作用。

目前，对于细菌铜抗性的研究工作取得了较大进展，发现了许多与铜抗性相关的基因，初步预测了相应基因编码蛋白的表达和调控，但是完整的代谢调控过程还不清晰。而且不同细菌的铜抗性基因和机制也不尽相同，所以对细菌铜抗性的研究还有很多工作要做。今后的研究应主要集中在以下几方面：（1）通过转录组学研究整个调控系统的变化；（2）通过对启动子的研究阐述细胞从接受铜刺激到启动相关基因的表达的精确机制；（3）研究不同细菌抗铜机制之间的的联系。

6 结 语

近年来细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch，BFB）的大面积爆发给当地瓜农造成了巨大的损失，严重威胁了西甜瓜产业的健康发展[36]。目前铜制剂是防治细菌性果斑病的主要杀菌剂[37]，随着该类杀菌剂的广泛使用，环境中的重金属污染日益严重，由于微生物细菌易变异和适应性强的特点，致病菌产生了抗重金属的能力，而且由此导致的致病性也进一步增强；由于许多致病菌的抗性基因即是毒力基因，因此，通过对病原菌重金属解毒机制的研究来探索其毒力机制，将有助于瓜类细菌性果斑病的有效防治。

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收稿日期： 2014-03-07； 修回日期： 2014-03-25

基金项目： 公益性行业（农业）科研专项（201003066）； 国家西甜瓜产业技术体系建设专项（CARS-26）； 中国农业科学院科技创新工程

作者简介： 李 强，男，在读硕士生，研究方向：植物病害综合治理。电子信箱： 405450149@qq.com

通信作者： 胡 俊，男，教授，植物病害综合治理。电子信箱： hujun6202@126.com

赵廷昌，男，研究员，分子植物病理学。电话：010-62815933； 电子信箱： tingchangzhao@gmail.com