RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展

薛莹莹 孙守如 孙德玺 邓云 朱迎春 刘君璞

摘 要： RGA克隆法是利用抗病基因产物的保守结构域人工设计简并引物，以植物gDNA或cDNA为模板进行PCR扩增而克隆植物抗病基因同源序列的方法。随着各种植物基因组测序计划的完成及计算机和生物信息学的发展，植物抗病基因的克隆取得了很大进展，目前人们已经从植物中克隆得到100多个抗病基因。研究表明，大多数抗病基因都存在NBS-LRR、STK、LZ、TIR等功能保守的结构域，其中大部分都为NBS-LRR类型，利用NBS-LRR保守结构域设计PCR引物已经从植物中扩增出大量的RGA。简要综述了已克隆NBS-LRR类抗病基因的结构特点和功能、RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展，并探讨其未来的发展与应用。

关键词： RGA； NBS-LRR； 抗病基因； 西瓜； 甜瓜； 黄瓜

Cloning of NBS-LRR-encoding Resistance Gene Analogues Using RGA Approach and the Advance in Cucurbit Crops

XUE Ying-ying1，2， SUN Shou-ru1， SUN De-xi2， DENG Yun2， ZHU Ying-chun2， LIU Jun-pu2

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002， China; 2. Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS， Zhengzhou， Henan 450009， China）

Abstracts： As majority resistance genes encode a highly conserved protein domain，RGA approach is a method of using the conserved protein domain design degenerate primers to clone resistance gene analogs from plant gDNA or cDNA. With the assembling of genome sequence in various plant species and the development of bioinformatics，the cloning of plant disease resistance genes have made great progress，more than 100 resistance genes have been cloned. Related studies showed that majority of plant disease resistance genes encode a conserved NBS-LRR，STK，LZ，TIR functional structure and majority of them belonging to NBS-LRR class. Using conserved NBS-LRR-encoding domain to design degenerate primer has amplified a number of RGA. In this article，the structure characteristics and function of NBS-LRR-encoding resistance genes and the advance in cloning NBS-LRR-encoding resistance genes using RGA approach and application in cucurbit crops has been reviewed and its future development and application has also been discussed.

Key words： RGA； NBS-LRR； Resistance gene； Watermelon； Melon； Cucumber

植物在生长发育过程中均会受到病虫不同程度的侵害，其中包括细菌、真菌、病毒、线虫、螨虫和昆虫。在与有害生物的长期抗争中，植物逐渐进化出了一系列复杂的防御机制来保护自己，一类是依靠简单的物理屏障和化学反应，另一类则是基于1971年Flor提出的“基因对基因假说”，在植物和侵染病原物之间产生复杂的生化反应，其中植物抗病基因（R基因）在识别病原物无毒基因Avr产生的蛋白效应子中起重要作用[1]。自从1992年Johal等[2]克隆得到第一个抗病基因——玉米抗圆斑病基因Hm1后，目前人们已经从植物中克隆得到100多个抗病基因[3]。基于抗病基因中功能保守结构域，可从广义上将植物抗病基因至少分为5类：第1类以玉米HM1基因为代表，编码HC-毒素还原酶，目前只有HM1基因1个；第2类为NBS-LRR类，占R基因总数的72%；第3类以番茄Pto基因为代表，编码STK蛋白激酶结构域，占R基因总数的3%；第4类以Xa21为代表，编码胞外LRR和一个胞内激酶结构域，占R基因总数的3%；第5类以番茄Cf基因为代表，编码一个胞外的TM-LRR和一个胞内的STK 激酶，占R基因总数的11%。除第1类外的R基因编码均可识别病原物Avr基因产生的蛋白受体，符合“基因对基因假说”，还有一些其他类抗病基因占R基因总数的11%[4]。可见NBS-LRR类抗病基因在植物R基因中占有重要地位，因此，植物NBS-LRR类抗病基因的克隆对植物抗病机制的研究、植物基因工程改良及抗病品种的选育等方面具有重要意义。

1 NBS-LRR类植物抗病基因编码蛋白的结构特点和功能

R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成部分，在目前已经发现的植物抗病基因中，NBS-LRR类占了绝大多数，且进化程度很高，被推测存在于细胞质中。该类抗病基因所编码蛋白的结构特点是具有核苷酸结合位点（NBS）、富亮氨酸重复（LRR）和N端的一些结构域，根据N端结构的不同，又可以将NBS-LRR基因分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两大类，简称TNL和non-TNL，其中TIR为果蝇Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体的胞外相似区域，non-TNL主要是在N端含有一个CC卷曲螺旋结构。Van der Biezen等[5]在1998年提出NB-ARC结构域是一种植物抗病基因产物和动物细胞死亡调控子所共有的新的信号基序，并且可能揭示了在植物、线虫和哺乳动物中细胞程序性死亡调控核心的某些保守性。

NBS结构域是NBS-LRR基因编码蛋白中最保守的部分，含有8个保守基序，包括P-loop（又称Kinase-1a）、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水结构域等。其中P-loop用于结合ATP或GTP的磷酸，其共有序列为GM（G/P）G（I/L/V）GKTTLA（Q/R）；Kinase-2a的特点是4个疏水氨基酸残基后紧跟1个不变的带负电荷的天冬氨酸，但在植物中，这一区域的两端还具有高度保守的氨基酸，共有序列为K（R/K）x LLVLDDV（W/D），参与磷酸转移反应；Kinase-3a保守区含有一个酪氨酸（Y）或精氨酸（R）残基，参与结合嘌呤或核糖；GLPL疏水结构域的共有序列为GGLPL（A/G）LK[6]。NBS结构域能够结合ATP或GTP，在植物抗病的过敏性反应生理过程中，可能参与抗病信号的传导。NBS 存在于真核生物的许多蛋白中，如ATPase、延伸因子异质三聚体、GTP结合蛋白、R基因编码蛋白等，这些蛋白对于细胞的生长、分化、细胞骨架的形成、小泡运输和防御反应都起关键性的作用[7]。

LRR是一段连续且重复的富含亮氨酸的氨基酸序列，胞内的LRR结构模式不很规则，多样性较高，基本骨架模型为LxxLxxLxxLxLxxxx（x为不确定的氨基酸），空间结构由α螺旋和β折叠构成，有利于和其他分子紧密结合，被认为在病原体识别上起作用。Hwang 等[8]对番茄抗线虫基因Mi-1.2和其横向同源基因Mi-1.1的研究表明，LRR不仅在病原体识别上起作用，在下游信号传导中也起作用。

2 RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因的研究进展

RGA法又称为同源序列克隆法，其原理是利用抗病基因蛋白产物的保守结构域，人工设计简并引物，以植物gDNA或cDNA为模板进行PCR扩增，得到植物的抗病基因同源序列（resistance gene analogs， RGA）。自1996年在PNAS上连续两篇关于用抗病基因产物的保守序列为引物来扩增RGA的文章发表以来，人们已经从多种植物中扩增到抗病基因同源序列[9]。RGA既可以是一种DNA分子标记，也可以是植物本身所携带的抗病基因，在植物中普遍存在，多以成簇的方式随机分布于植物基因组中。它与R基因之间存在3种关系：第一，与已知抗病基因具有很高的相似性或为抗病基因的一部分；第二，与已知抗病基因连锁或为抗性基因家族成员；第三，与抗病基因无关，只是序列上存在相似性。所以RGA 与植物抗病基因仍然有较大区别，但它们均含有抗病基因编码蛋白的保守结构域，最有可能参与植物抗病反应过程，可作为候补抗性基因，再通过与已知的遗传图谱进行分析比较，就可以确定它们与已知抗病基因的关系或克隆出新的抗病基因。这一方法已经成为分离克隆和寻找新的抗病基因的最简捷、最经济和最有效的途径[9-10]。

自从1996年Kanazin等[11]和Yu等[12] 分别利用NBS-TM和NBS保守结构域设计引物从大豆基因组中获得RGA 以来，抗病基因同源序列克隆法已得到广泛应用，现已从水稻[13]、玉米[14]、大麦[15]、小麦[16]、拟南芥[17]、番石榴[18]、菜豆[19]、丝瓜[20]、花生[21]、芒果[22]等多种植物中扩增出抗病基因同源序列。Okuyama等[23]从水稻的12条NBS-LRR类RGA中筛选得到抗稻瘟病基因Pia，且稻瘟病菌中含有AVR-Pia无毒基因，符合“基因对基因”假说。 Calenge等[24]利用苹果中高度保守的NBS结构域内的P-loop基序设计简并引物，最终得到43条分子标记，其中23条为RGA分子标记，25条分子标记与抗病基因主效基因或者QTL紧密连锁。Perazzolli 等[25]在2014年从苹果中分离得到868条RGA并研究了它们在蔷薇科中的进化史。Hunger等[26]利用抗病基因保守序列设计简并引物从甜菜中扩增得到47条RGA并对其进行了连锁性分析，其中21条为NBS-LRR类抗病基因同源序列。Tian等[27]也根据NBS-LRR保守结构域设计简并引物扩增甜菜RGA，结果表明甜菜基因组中可能缺失TIR类型的RGA。安然等[28]以柑橘的gDNA为模板，根据NBS-LRR保守结构域设计简并引物，从对柑橘溃疡病菌表现不同抗性的6个柑橘品种中扩增得到9条RGA，并对其进行了分析和Sourthern鉴定，为定位、克隆柑橘抗病基因及利用分子标记辅助选择育种提供了研究基础。Rout等[29]利用NBS-LRR抗性基因编码蛋白中的NBS保守结构域设计简并引物，从抗FBR（洋葱干腐病）的大蒜材料中分离到28条RGA，qRT-PCR分析它们在根、茎、叶中的表达水平，结果显示其中一条命名为AsRGA29的RGA受FOC侵染后表达量显著上调，进一步研究表明，在SA、MeJa、H2O2和ABA四种防御信号分子处理下也得到相同结果。该研究虽然没有得到FBR抗病基因，但是为今后研究与FBR抗病基因连锁的RGA分子标记奠定了基础。目前成功的案例有Paal等[30]以马铃薯NBS同源序列St332为探针最终克隆得到抗马铃薯金线虫Gro1-4基因，Chen等[31]以茄科植物抗病基因保守结构域设计简并引物并结合RACE技术从辣椒中克隆得到根结线虫抗病基因CaMi。

3 NBS-LRR类RGA在葫芦科作物中的研究进展

葫芦科作物中的西瓜、甜瓜和黄瓜是我国重要的经济作物。丁国华等[32]利用简并引物从黄瓜基因组DNA中分离得到15条NBS类RGA，其中10条为可通读序列，且与已报道的甜瓜RGA有较高同源性。Huang 等[33] 2009年公布了黄瓜基因组序列，分析发现黄瓜中仅有61条NBS类抗病基因，在数量上和番木瓜中55条NBS类抗病基因相近，但是远低于拟南芥（200条）、白杨（398条）和水稻（600条）中NBS类抗病基因的数量。Harris等[34]根据NBS-LRR抗病基因家族中的NBS保守结构设计简并引物，从西瓜材料‘Calhoun Gray、‘PI296341和‘PI595203中克隆得到66条RGA片段，测序结果显示这些WRGA含有NBS-LRR抗病基因保守结构基序，聚类分析将WRGA分为8组分别包含TNL和non-TNL类型，其中WRGA1、WRGA7和WRGA147被定位于第13连锁群8 cM的区域内，因为它们分属于不同的TNL类抗病基因同源序列，却被定位在同一连锁群上，表明该区域上很可能存在抗病基因，有待于进一步研究。Guo等[35]以西瓜材料‘PI97103构建西瓜基因组图谱，在西瓜基因组中仅发现44条NBS-LRR基因，远低于水稻、苹果和玉米中NBS-LRR基因的数量。Brotman等[36]根据已知抗病基因设计简并引物从甜瓜中分离得到15条NBS-LRR基因家族的同源序列，其中几条NBS-LRR相关序列定位于抗番木瓜环斑病毒病、抗枯萎病Fom-1和Fom-2、抗蚜虫基因位点附近，为甜瓜抗病育种分子标记的应用和R基因的克隆奠定了基础。Garcia-Mas等[37] 2012年公布了甜瓜双单倍体DHL92的基因组序列，其中细胞质NBS类抗病基因总数量为 81个，而同类别的抗病基因在拟南芥、葡萄和水稻中的总数量分别是212、302和548个，这些数据显示NBS-LRR类基因数目在植物中并不保守，而且在甜瓜属中的数值更低，可能该类物种中NBS-LRR类基因发生了相似的进化。Wan等[38]比较了葫芦科作物NBS类抗病基因同源序列的系统进化关系，系统发生分析显示，基因复制、序列差异和基因缺失是葫芦科植物NBS类基因进化的三大主要模式。

4 存在问题及展望

自从1996年RGA法出现以来，人们已经从多种植物中克隆得到抗病基因同源序列，但是成功得到植物抗病基因的例子却不多，因为RGA并不等同于抗病基因，可能是R基因的一部分或者与之连锁，也可能与R基因没有关系。其中，Paal等[30]和Chen等[31]分别成功克隆得到了马铃薯Gro1-4和辣椒CaMi抗病基因，这2个基因均存在于茄科植物，且简并引物的设计模板也是源自茄科植物。这可能说明2个问题：第一，茄科植物内NBS类抗病基因保守性较高；第二，同一科属内植物间的NBS类抗病基因保守性较高。虽然NBS-LRR类抗病基因存在保守结构域，但是不同种属之间仍然有较大的序列差异，在利用RGA法克隆抗病基因时应当引起注意。

葫芦科作物黄瓜、西瓜和甜瓜基因组测序已经完成，这3种植物内的NBS-LRR类抗病基因也逐渐呈现在人们面前。研究表明，黄瓜、西瓜和甜瓜基因组中NBS-LRR类抗病基因数量相对比拟南芥、水稻等植物都显示较低水平，可能是植物本身NBS-LRR类抗病基因在进化过程中缺失，也可能是还有部分NBS-LRR类抗病基因人们尚未发现。Jupe[39]在2013年应用RenSeq方法（RenSeq： Resistance gene enrichment and sequencing method，抗性基因富集测序法）成功在已经完成了基因组测序和分析的马铃薯中将NBS-LRR数量从438条增加到755条，可能将来也会应用到葫芦科植物抗病基因的克隆中，为发现新的葫芦科植物抗病基因提供技术支持。

随着计算机技术和生物信息学的快速发展，越来越多的植物基因组序列将会呈现在人们面前，在今后的研究中势必要求我们开发更高效的技术手段发现新的抗病基因，同时，结合先进的基因芯片、RenSeq等技术，优化RGA的分离方法，并运用生物信息学快速识别、比较更多的RGA，预测其中的基因结构及功能，从而为后续研究奠定基础。

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收稿日期： 2014-03-28； 修回日期： 2014-04-10

基金项目： 国家西甜瓜产业技术体系项目（CARS-26-14）； 中国农业科学院基本科研业务费（0032012024）

作者简介： 薛莹莹，女，在读硕士研究生，研究方向为蔬菜遗传育种与分子生物学。电话： 15824893361； 电子信箱： henauxyy@126.com

通信作者： 刘君璞，男，研究员，主要从事西瓜遗传育种及栽培技术研究。电子信箱：liujunpu@caas.cn