西瓜未成熟胚高效再生体系的建立

董焱 张洁 张海英 宫国义 郭绍贵 任毅 许勇

摘 要：为了建立西瓜高效遗传转化的再生体系，以西瓜杂交品种‘秀玲、自交系‘97103和野生种质‘PI296341的未成熟胚为外植体，分析了基因型、未成熟胚发育时间和植物生长调节剂等因素对体外再生率的影响，获得了西瓜离体培养再生植株。结果表明，以授粉后24 d的西瓜未成熟胚为外植体，在MS＋SH维生素＋6-BA 2.2 mg·L-1培养基上，‘秀玲、‘97103和‘PI296341的未成熟胚外植体能够诱导出不定芽，不定芽诱导率为87.78%、82.78% 和86.11%，不定芽在MS＋SH维生素＋6-BA 0.2 mg·L-1＋IAA 0.02 mg·L-1培养基上伸长、展叶，在MS＋IBA 1.0 mg·L-1的培养基上诱导生根得到完整的再生植株。以未成熟胚为外植体获得再生植株的途径，可为西瓜遗传转化提供有效的受体系统。

关键词： 西瓜； 未成熟胚； 再生

Plant Regeneration from Immature Embryos of Watermelon

DONG Yan1，2， ZHANG Jie2， ZHANG Hai-ying2， GONG Guo-yi2， GUO Shao-gui2， REN Yi2， XU Yong1，2

（1.Plant Science and Technology College， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206 China； 2. Beijing Vegetable Research Center， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097 China）

Abstract：In order to obtain watermelon regeneration system for genetic transformation，the immature embryos of watermelon ‘Feeling，‘97103and‘PI296341were taken as explants in this experiment. The impact the immature embryo development time，genotypes and plant growth regulators on the rate of regeneration were explored and regenerated plantlets were obtained. Adventitious buds were regenerated in MS＋SH Vitamin＋6-BA 2.2 mg·L-1，and the regeneration rates were 87.78%，82.78% and 86.11% for 3 genotypes tested. The regenerated buds grew into shoots in the MS medium with 6-BA 0.2 mg·L-1＋IAA 0.02 mg·L-1，and rooted in MS+IBA 1.0 mg·L-1. The result indicated that the plantlet regeneration system from immature embryos can be a proper system for genetic transformation in watermelon.

Key words： Watermelon； Immature embryos； Regeneration

西瓜（Citrullus lanatus）为葫芦科（Cucurbitaceae）西瓜属一年生草本蔓生植物，是一种重要的园艺作物。西瓜遗传基础狭窄，种质资源缺乏，很多重要的性状无法通过常规育种方法进行改良。基因工程技术就成为对常规育种的有效补充手段。近年来，植物基因工程的理论和实践逐步走向成熟和完善，并成为现代生物技术的核心领域，亦是农作物品种改良的重要手段。转基因能够定向改良西瓜性状，并且是基因功能验证的重要手段，而开展这些工作的前提是建立西瓜高效体外再生系统。

国内外许多学者已经相继采用顶芽[1]、子叶[2]、下胚轴[3]、花药[4]和原生质体[5]等进行西瓜组织培养和遗传转化技术。但是与番茄等园艺植物相比，西瓜体外再生能力弱、不容易通过愈伤组织途径获得再生植株，存在着高效基因型少、再生频率低、分化芽伸长慢、易出现玻璃化苗等问题[6-8]，此外，不同研究者所得的结论存在很大的差异，重复性差，目前还缺乏对西瓜体外再生技术的系统研究。这严重制约着基因工程技术在西瓜遗传改良与基因功能验证中的应用。

不同研究结果表明，基因型和外植体类型是影响体外再生效率的决定性因素[9-10]。此外，植物生长调节剂的配比对再生率也有显著影响[11]。本试验首次采用西瓜未成熟胚为外植体材料，分析了未成熟胚发育时间、基因型和植物生长调节等因素对再生率的影响，建立了稳定、高效的西瓜离体再生体系，可以成为遗传转化体系有效的受体系统，为推动西瓜转基因研究奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西瓜杂交品种‘秀玲购于台湾农友种苗公司，西瓜自交系‘97103、西瓜野生种质‘PI296341由北京市农林科学院蔬菜研究中心西瓜育种实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 外植体的获得 采集授粉后18~30 d 的西瓜于75% 乙醇中浸泡消毒10 min，在超净台中火焰灭菌后，用无菌刀取出种子，于无菌水中清洗3次，在滤纸上吸干水分；切去种壳，将未成熟胚生长点切除，靠近生长点切去0.5 cm×0.5 cm切块，再沿主脉切成两半。

1.2.2 不定芽出芽诱导 将外植体接种到不定芽诱导培养基中。基础培养基为MS培养基，含有SH维生素[12]，3% 的蔗糖和0.7% 的琼脂。不定芽诱导培养基MS+6-BA 2.2 mg·L-1（培养基1）和不定芽伸长培养基MS+6-BA 0.2 mg·L-1+IAA 0.02 mg·L-1（培养基2），至不定芽长到5~8 cm（表1）。培养温度为（28±2）℃，光周期为16 h，光照强度为20 000 lx左右。4周以后观察外植体的生长情况。

1.2.3 幼苗生根诱导 切取完整幼苗，转入MS+

IBA 1.0 mg·L-1培养基（培养基3）中诱导生根，2周左右可获得生根植株，或进行试管苗嫁接得到完整植株（表1）。

表1 西瓜未成熟胚再生苗诱导培养基编号

1.2.4 数据统计与分析 设置3组独立重复试验，统计每组重复中诱导形成不定芽的外植体数量，将不定芽诱导率（诱导率/%=出芽外植体数量/总外植体数量×100）和不定芽成苗率（成苗率/%=成苗不定芽数量/总不定芽数量×100）作为评价西瓜再生率的指标，对数据进行平均值（Mean）和标准差（SD）计算及显著差异性分析。

2 结果与分析

2.1 西瓜未成熟胚发育时间对不定芽诱导及发生途径的影响

采集授粉后18~30 d的西瓜‘秀玲新鲜果实，将种子未成熟胚用于离体再生试验。结果显示：授粉后18 d的西瓜种子种皮呈白色，内部扁平，没有种仁或种仁很小呈水状（图版-1、4），这种幼胚不能用做外植体。授粉后20~24 d的西瓜，随着授粉时间增加，未成熟胚外植体的不定芽诱导率上升（表2）。授粉后24 d的西瓜种子饱满，种皮白色透着粉红色，幼胚水嫩且没有完全成熟（图版-2、5），这种未成熟胚作为外植体最有利于诱导形成不定芽，在不定芽诱导培养基中外植体四周都能诱导出不定芽，且一个外植体能诱导2~4个不定芽（图版-9、10）。授粉后30 d的西瓜种子种皮已经全部木质化变成褐色，幼胚趋于成熟（图版-3、6），授粉时间大于24 d的种子幼胚，不定芽诱导率下降（表2），且只有靠近生长点的部分能诱导出不定芽（图版-11、12、13）。

表2 不同未成熟胚成熟时间对

不定芽诱导率的影响

[注] 表中同列数字后不同小写字母表示差异显著（P=0.05），品种为‘秀玲，后表同。

2.2 不同品种（系）西瓜的未成熟胚不定芽的诱导率

为了进一步明确不同基因型的未成熟胚不定芽的诱导率，本试验对供试3个西瓜品种（系），杂交品种‘秀玲、自交系‘97103和野生种质‘PI296341的授粉后24 d的未成熟胚，进行不定芽诱导试验。试验结果表明3个品种（系）平均不定芽诱导率分别为87.78%、82.78%和86.11%（表3）。说明以未成熟胚为外植体建立的西瓜再生体系对基因型的依赖性不强。因此，以未成熟胚为遗传转化的受体，有望克服其品种局限性。

表3 不同品种（系）西瓜未成胚不定芽的诱导率

2.3 植物生长调节剂对未成熟胚不定芽诱导的影响

将西瓜未成熟胚外植体接入含有不同质量浓度6-BA（1.4~2.4 mg·L-1）的培养基上，白色的胚渐渐转绿（图版-7、8），7 d后完全呈现绿色，光滑表面逐渐变得粗糙，形成拟分生组织，14 d后拟分生组织发育为多个凸起的不定芽（图版-16）。随着6-BA浓度增高，未成熟胚外植体不定芽诱导率升高（表4），但是形成畸形芽的概率也同样增高（表5），易造成密集丛生芽（图版-14）和玻璃化现象（图版-15）。试验结果显示：6-BA质量浓度为2.2 mg·L-1和2.4 mg·L-1时，不定芽诱导率差异不显著，而畸形芽诱导率差异显著，说明6-BA质量浓度为2.2 mg·L-1时，最有利于不定芽的诱导。

表4 不同质量浓度6-BA对西瓜

不定芽诱导率的影响

表5 不同质量浓度6-BA对西瓜

不定芽畸形现象的影响

[注] 畸形芽率/%=形成畸形芽的外植体数量/总外植体数量×100。

2.4 植物生长调节剂对未成熟胚不定芽伸长的影响

将不定芽转入含有较低质量浓度6-BA（0~0.4 mg·L-1）和一定质量浓度IAA（0~0.04 mg·L-1）的培养基中伸长、展叶（图版-17），试验结果表明，含有6-BA 0.2 mg·L-1＋IAA 0.02 mg·L-1的培养基中的未成熟胚外植体不定芽成苗率最高（表6、图版-18）。植物生长调节剂浓度过低，不定芽伸长缓慢，不利于成苗，而高浓度的IAA会抑制不定芽伸长成苗，不定芽易横向生长形成丛生芽。

3 讨论与结论

3.1 不同品种对西瓜未成熟胚离体再生没有显著影响

基因型是影响植物体外再生的内在因素，过去20 a（年）的体外再生研究表明西瓜体外再生有很强的基因型依赖性[13-14]，由此导致西瓜再生体系的品种局限性。西瓜再生研究以子叶等为外植体的居多，不同西瓜品种子叶外植体的诱导率差异很大。Compton等[15]以不同品种子叶外植体为材料进行研究，发现其不定芽率有很大差别，目前大多数相关研究均支持这一结论。Suratman等[16]利用二倍体和三倍体西瓜子叶外植体进行体外再生试验，结果三倍体比二倍体西瓜的不定芽诱导效果更好。Akashi等[17]利用野生西瓜子叶外植体进行体外再生体系的研究，发现西瓜野生品种（Citrullus lanatus sp.）比西瓜栽培品种（Citrullus lanatus cv.）更有利于组织培养。Nunˇez-Palenius等[13-14]以52种商业西甜瓜品种子叶外植体进行研究，其中能够诱导出不定芽的品种为供试品种的12.5%。本试验供试3个西瓜品种（系），杂交品种‘秀玲、自交系‘97103和野生种质‘PI296341的未成熟胚都能够形成再生植株，且不定芽诱导率相差不明显。说明以未成熟胚为外植体建立的西瓜再生体系对基因型的依赖性不强。可见授粉后24 d的未成熟胚细胞还具有一定的分化能力，而子叶等其他形式的外植体细胞分化程度比较高，脱分化能力受基因型影响较大。因此，以未成熟胚为遗传转化的受体，有望克服其品种局限性。

3.2 西瓜未成熟胚的发育时间是影响西瓜离体再生的关键因素

西瓜成熟种子采集后进入休眠期，经过长时间贮藏，解除休眠后萌发的种子，再生率下降，不利于不定芽的诱导。因此，西瓜种子经过贮藏后，形成成熟的胚芽，成熟胚除胚芽、胚根生长点处的细胞外，分生能力、分化能力均比不成熟胚细胞下降，因此不利于不定芽的诱导。本试验对授粉后18~30 d的西瓜种子未成熟胚外植体进行体外再生试验研究，发现授粉后24 d的西瓜种子未成熟胚饱满，活性最好，这种种子的未成熟胚最有利于不定芽的诱导，未成熟胚外植体四周都能诱导出芽，且一个外植体能诱导出2~4个不定芽，不定芽诱导率达到87.78%。授粉时间少于18 d的西瓜未成熟胚还没开始发育，不能用于体外再生，随着授粉时间的增加，未成熟胚成熟度增加，细胞分化能力降低，不定芽诱导率下降，且只有靠近生长点端能诱导出芽。

3.3 6-BA是西瓜离体再生必需的植物生长调节剂

细胞分裂素是细胞分化为完整植株的决定性外源激素，高浓度细胞分裂素能够诱导组织进行脱分化形成愈伤组织，而在含有低浓度细胞分裂素和生长素的培养基上，不定芽能够顺利伸长并发育成植株。研究表明，6-BA的浓度对不定芽的诱导影响不是很大，且附加IAA会导致愈伤组织过度生长而抑制不定芽的分化。玉米素也有类似的效果[18]。但也有不同结论，郝立新和王怀名[19]报道，将西瓜子叶接种到MS+5.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IAA培养基上，最有利于不定芽的诱导。Choi[1]等将西瓜子叶在仅附加1.0 mg·L-16-BA的MS培养基上诱导不定芽。王春霞等[20]将西瓜子叶接种到MS盐类+维生素B5+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 IAA培养基上，子叶的出芽率最高。总之，由西瓜子叶诱导不定芽，6-BA是至关重要的，其质量浓度一般为1.0~5.0 mg·L-1。6-BA质量浓度过高会加剧试管苗的玻璃化，Vedat等[18]研究表明超过4 mg·L-16-BA或者KT会引起不定芽的畸形和严重玻璃化。西瓜组织培养过程中玻璃化现象极为普遍，几乎不可避免[21]，甚至可以导致整个工作的失败。培养基和激素类型、琼脂浓度、渗透调节物质、通气情况等均与此有关。

低浓度的6-BA附加一定浓度IAA的培养基则有利于不定芽伸长、展叶[22]。西瓜子叶诱导不定芽常常形成芽丛，要经过芽伸长后才能分化成完整植株。汤绍虎等[23]将顶芽诱导的丛生芽转入MS+2.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 GA3培养基上，半个月内芽大部分伸长20~30 mm，而且生长健壮。万勇等[24]认为MS附加0.5 mg·L-1BA＋1.0 mg·L-1 IAA为最佳继代增殖培养基。而张志忠等[25]将丛生芽分株移入MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA的培养基上获得很好的伸长效果。本试验在含有2.2 mg·L-16-BA的培养基上能够诱导西瓜未成熟胚形成不定芽。在含较低质量浓度0.2 mg·L-1 6-BA和0.02 mg·L-1 IAA的培养基上伸长、展叶，从而得到更多有价值的再生植株。

这种以未成熟胚为外植体获得再生植株的途径，解决了以西瓜子叶、胚根等为外植体再生体系的基因型依赖性强、诱导率低、重复率低等问题，可以为遗传转化提供有效的受体系统，因此有广阔的利用前景。（本文图版见彩插21版）

参考文献

[1]Choi P S，Soh W Y，Kim Y S，et al. Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumafaciens[J]. Plant Cell Rep，1994，13（6）： 344-348.

[2]Zhang X P，Rhodes B B，Adelberg J W. Shoot regeneration from immature cotyledons of watermelon[J]. Cucurbit Genetics Cooperative Report，1994，17： 111-115.

[3]薛光荣，余文炎，费开伟，等. 西瓜花药离体培养获得花粉植株[J].植物生理讯，1983，4： 40-42.

[4]宋道军，陈若蕾，尹若春，等. 西瓜高效组织培养再生体系的初步研究[J]. 中国西瓜甜瓜，2000，（4）： 8-11.

[5]Park S M，Lee J S，Jegal S，et al. Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV（cucumber green mottle mosaic virus） infection[J]. Plant Cell Rep，2005，24（6）： 350-356.

[6] Lin Ching-Yi，Hsin-Mei K，Chiang Yi-Hua，et al. Development of transgenic watermelon resistant to Cucumber mosaic virus and Watermelon mosaic virus by using a single chimerical transgenic construct[J]. Transgenic Res，2012，21（5）： 983-993

[7]Cho M A，Song Y M，Park Y O，et al. The use of glufosinate as a selective marker for the transformation of cucumber（Cucumis sativus L.）[J]. Korean Journal of Plant Biotechnology，2005，32（3）： 161-165.

[8]黄学森，焦定量，那 丽. 西瓜子叶离体培养获得再生植株[J].中国西瓜甜瓜，1994（3）： 15-16.

[9]Cho M A，Moon C Y，Liu J R，et al. Agrobacterium-mediated transformation in Citrullus lanatus[J]. Biologia Plantarum，2008，52（2）： 365-369.

[10]Erzsébet Kiss-Bába，Sarolta Pánczél，Velichl I，et al. Influence of genotype and explant source on the in vitro regeneration ability of different melon varieties[J]. Acta Biologica Hungarica，2010，61（4）： 498-511.

[11]Cho M A，Park Y O，Kim J S，et al. Development of transgenic maize（Zea may L.）using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation[J]. Kor J Plant Biotechnol，2005，32（2）： 91-95.

[12]Huang Ying-Chih，Chiang Chu-Hui，Li Chin-Mei，et al. Transgenic watermelon lines expressing the nucleocapsid gene of Watermelon silver mottle virus and the role of thiamine in reducing hyperhydricity in regenerated shoots[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult，2011，106（1）： 21-29.

[13]Nunˇez-Palenius H G，Grumet R，Lester G，et al. Melon fruits： genetic diversity，physiology，and biotechnology features[J]. Crit Rev Biotechnol，2008，28（1）： 13-55.

[14]Nunˇez-Palenius H G，Cantliffe D J，Huber D J，et al. Transformation of a muskmelon ‘Galia hybrid parental line（Cucumis melo L. var. reticulatus Ser.）with an antisense ACC oxidase gene[J]. Plant Cell Rep. 2006，25（3）： 198-205.

[15]Compton M E，Gray D J. Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from cot yledons of tetraploid watermelon[J]. HortScience，1994，117（3）： 211-213.

[16]Suratman F，Huyop F，Parveez G K A. In vitro shoot regeneration of Citrullus vulgaris schrad（watermelon）[J]. Biotechnology，2009，8（4）： 393-404.

[17]Akashi K，Morikawa K，Yokota A. Agrobacterium-mediated transformation system for the drought and excess light stress-tolerant wild watermelon（Citrullus lanatus）[J]. Plant Biotechnol，2005，22（1）： 13-18.

[18]Vedat P，Ahmet O，Hakan Y，et al. Advent itious shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of diploid diyarbakir Watermelon（Citrullus lanatus cv. “Sürme”）[J]. Turkish Journal of Biology，2003，27（2）： 101-105.

[19]郝立新，王怀名. 西瓜再生体系的建立[J]. 华北农学报，1998，13（3）： 112-115.

[20]王春霞，简志英，刘 愚，等. 京欣1号西瓜子叶组织培养的研究[J]. 园艺学报，1996，23（4）： 401-403.

[21]Thomas P，Mythili J B，Shivashankara K S. Explant medium and vessel aeration affect the incidence of hyperhydricity and recovery of normal plantlets in triploid watermelon[J]. Horticultural Science and Biotechnology，2000，75（1）： 19-25.

[22]Galperin M，Patlis L，Ovadial A，et al. A melon genotype with superior competence for regeneration and transformation[J]. Plant Breeding，2003，122（1）： 66-69.

[23]汤绍虎，廖映扮，徐荣灿. 无籽西瓜培养基的选择及培养研究[J]. 西南农业大学学报，1994，16（6）： 540-542.

[24]万 勇，张 铮. 西瓜组织培养快速繁殖的初步研究[J]. 江西农业学报，2002，14（4）： 47-50.

[25]张志忠. 几丁质酶基因和几丁质酶一葡聚糖酶双价基因导入西瓜的研究[D]. 福州：福建农林大学，2004.

收稿日期： 2014-03-21； 修回日期： 2014-03-27

基金项目： 国家863计划项目（2012AA100103）； 国家科技支撑项目（2012BAD50G01、2012BAD02B03、2013BAD01B04）

作者简介： 董 焱，女，在读硕士研究生，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术。电话： 13520777405； 电子信箱： dongyan575@163.com

通信作者： 许 勇，男，研究员，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术。电话： 010-51503199； 电子邮箱： xuyong@nercv.org