西瓜嗜酸菌tatB基因生物信息学分析

蒋洁　杨玉文　王铁霖　杨姗姗　赵廷昌

摘 要： 为了解西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）双精氨酸转运系统（Twin-arginine translocation system，Tat）关键基因tatB的生物信息学信息，利用相关软件对西瓜嗜酸菌和其他7种革兰氏阴性菌的TatB蛋白进行理化性质分析，氨基酸序列分析以及遗传距离分析；同时对西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性、跨膜结构域以及三级结构模型进行了预测。结果表明，西瓜嗜酸菌TatB的理化性质和洋葱布克氏菌（Burkholderia cenocepacia）更加接近，水稻白叶枯病菌TatB理化性质与其他6种细菌的相差较远；西瓜嗜酸菌TatB蛋白遗传关系与水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）的最远，与洋葱酸皮病菌以及茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的较为接近；预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白有3个区域的疏水性比较高，在氨基酸序列的2～18位以及100～106位有2个跨膜区域，其三级结构可能为“L”型。对西瓜嗜酸菌tatB基因进行基本生物信息学分析，丰富了其生物信息学资料，有助于对西瓜嗜酸菌的致病机制进行深入研究，为以后选育抗病品种以及研发特异性的新药提供依据。

关键词： 西瓜嗜酸菌； tatB基因； 生物信息学分析

Abstract： In order to learn basic knowledge of tatB gene in Acidovorax citrulli，the pathogen for bacterial fruit blotch（BFB），we used the method of bioinformatics to analyze TatB proteins in eight bacteria including A. citrulli. We analyzed physical hydrophobicity，transmembrane domain，tertiary structure in TatB protein of A. citrulli. The results showed that the physical and chemical properties of A. citrulli were more similar to that of Burkholderia cenocepacia. The TatB protein of A. citrulli was closer to that of B. cenocepacia and Ralstonia solanacearum in genetic distances. There were three parts in the TatB protein，a hydrophobic domain and two transmembrane domains. We predicated that the tertiary structure is L-shape. The bioinformatic data of TatB protein and tatB gene can help us to explore the pathogenic mechanism of BFB and to create new fungicides.

Key words： Acidovorax citrulli； tatB gene； Bioinformatic analysis

西瓜嗜酸菌[Acidovorax citrulli （Schaad et al.）]引起的西瓜細菌性果斑病是西甜瓜产业上的毁灭性病害，给我国的西甜瓜产业造成了极大的损失[1]。和其他的革兰氏阴性菌一样， A. citrulli的致病性与其蛋白分泌系统有紧密联系[2]。许多研究都指出植物病原细菌的III型分泌系统与病原菌的致病力有重要联系[3]，但是对其他分泌系统与致病能力关系的报道比较少。双精氨酸转运系统（Twin-arginine translocation，Tat）是革兰氏阴性菌的两步分泌系统的重要组成部分[4]。革兰氏阴性菌的细胞膜由细胞内膜，周质空间和细胞外膜组成[5]。Tat主要负责将折叠好的蛋白质从细菌细胞内转运至周质空间，它在II型和V型分泌系统中比较常见[6]。

Tat系统主要由TatA、TatB、TatC和TatE组成，其中TatB和TatC处于核心地位[7]。有报道[8]指出，水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）中tatB和tatC基因的缺失会导致水稻白叶枯病菌的致病能力的降低。在梨火疫病菌（Erwinia amylovora）[9]和茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）[10]中Tat系统关键基因的缺失亦会导致病菌的致病力下降。

在西瓜嗜酸菌中还没有关于Tat系统的相关研究，本试验通过生物信息学分析的方法，对西瓜嗜酸菌的 tatB基因和TatB蛋白的理化性质、疏水特性、跨膜区域以及三级结构进行分析，为进一步研究该基因的相关功能打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 数据来源 相关细菌tatB基因的碱基序列和对应蛋白的氨基酸序列均来自NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）。选择水稻白叶枯病菌（X. oryzae）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、茄科雷尔氏菌（R. solanacearum）、洋葱酸皮病菌（Burkholderia cenocepacia）、十字花科假单胞菌（P. brassicacearum）、大肠杆菌（Escherichia coli）和梨火疫病菌（E.amylovora）中的tatB基因进行试验，这些菌均为革兰氏阴性，其中大肠杆菌的Tat系统研究比较深入，其余6种细菌与西瓜嗜酸菌一样均为植物病原细菌。

1.1.2 相关软件和在线工具 ProtParam（http；//web. Expasy.org/protpatam/），MEGA 4.0.2，Hmoment，Tmap， TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form.html），CDD search，Swiss-Model（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html），Protein Data Bank，PyMol.

1.2 方法

1.2.1 西瓜嗜酸菌tatB基因和TatB蛋白基本信息

在NCBI上面登录西瓜嗜酸菌标准菌株AAC00-1的全基因组序列查找到tatB基因，通过阅读基因注释了解该基因的基本功能；在Uniprot中找到AAC00-1的TatB蛋白了解该蛋白的基本信息。

1.2.2 分析8种细菌TatB蛋白理化性质 在NCBI上面下载8种细菌的TatB蛋白氨基酸序列，利用在线工具ProtParam（http：//web. Expasy.org/protpatam/）分析其理化性质的差异。

1.2.3 构建8种细菌TatB蛋白质的遗传进化树

在MEGA 5上对几种TatB蛋白的氨基酸序列进行比对并构建系统进化树分析进化距离采取NJ邻位法，自展检验，重复1 000次。

1.2.4 预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性 用EMBOSS软件包里的Hmoment软件进行疏水性预测，为进一步预测蛋白的跨膜结构打下基础。

1.2.5 预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜结构 用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_

form.html）在线工具和EMBOSS软件包里面的Tmap软件对西瓜嗜酸菌（A. citrulli）的TatB蛋白进行跨膜结构预测，为预测其三级结构做好准备。

1.2.6 模拟西瓜嗜酸菌TatB蛋白的三级结构 在NCBI上BLAST目的蛋白的氨基酸序列，了解该蛋白从属于哪个蛋白家族以及该蛋白家族的核心序列信息。运用NCBI上的在线工具CDD Search 找到该蛋白家族的主要分布情况，以及它们的保守核心序列的三维结构模型。通过Swiss-Model（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）往PDB（Protein Date Bank）中输入目的蛋白序列，最后利用PyMol软件显示预测出的三级结构模型。

2 结果与分析

2.1 西瓜嗜酸菌tatB基因和TatB蛋白基本信息

tatB基因为西瓜嗜酸菌基因组上的1 156 059至1 156 553位碱基，基因序号（Gene ID，GI）为

120 608 714，染色提上的编号为1 054。其CDS区域由495 bp碱基组成。翻译出来的TatB蛋白质位于细胞内膜具有164个氨基酸残基，是双精氨酸转运系统的重要组分，和TatA以及TatC一起负责转运折叠好的、信号肽上具有双精氨酸基序的底物蛋白质（表1）。

表1 Uniprot中西瓜嗜酸菌TatB蛋白总体注释

2.2 8种细菌TatB蛋白的理化性质

用ProtParam分析8种细菌的TatB蛋白的理化性质（表2），发现除了水稻白葉枯病菌的TatB蛋白的氨基酸残基组成超过了200个之外，其他7种细菌的TatB的氨基酸残基数都在140～190之间。西瓜嗜酸菌、茄科雷尔氏菌及洋葱酸皮病菌的理论等电点偏碱性且差距不大，其他细菌TatB的偏向酸性且差距较大。8种细菌的TatB蛋白质里面丙氨酸所占比重最大，其次所占比重较大的是亮氨酸和精氨酸。等电点偏碱性的TatB蛋白中其碱性氨基酸的比例较酸性氨基酸的大，等电点偏酸性的则相反。8种细菌的TatB蛋白中只有西瓜嗜酸菌和水稻白叶枯病菌的TatB蛋白稳定。除了水稻白叶枯病菌的TatB蛋白主要表现为疏水性外，其他细菌的TatB蛋白均为两性。

2.3 构建8种细菌TatB蛋白质的遗传进化树

比对8种细菌TatB蛋白的氨基酸序列后用MEGA5建立遗传进化树，结果见图1。结果表明西瓜嗜酸菌的TatB蛋白与茄科雷尔氏菌和洋葱酸皮病菌的为一类，它们的遗传距离比较近，而两种假单胞属的细菌的TatB蛋白质在同一个分枝说明它们TatB蛋白的亲缘关系更加接近。而水稻白叶枯病菌的TatB蛋白与其他几种细菌的遗传距离最远，这可能与其蛋白质的大小也有关系，从2.2中的理化性质分析中可知水稻白叶枯病菌的TatB蛋白与其他细菌的相差很大。

2.4 预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性

用EMBOSS软件包里的Hmoment软件对西瓜嗜酸菌的TatB蛋白进行疏水性预测结果见图2。软件预测，结果表明在西瓜嗜酸菌的3个部位的疏水性较强：1～10氨基酸残基处，90～105氨基酸残基处以及135氨基酸残基附近。预测目的蛋白可能存在2～3个跨膜结构区域。

2.5 预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜结构

使用在线工具TMpred和EMBOSS软件包里面的Tmap软件对西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜结构进行预测，发现目的蛋白在2～18位和100～106位氨基酸残基之间有两个明显的跨膜区域（图3和图4）。该结果与2.4中疏水性预测的结果相符。

2.6 模拟西瓜嗜酸菌TatB蛋白的三级结构

通过模拟目的蛋白质的三级结构模型，可以更形象地将它的功能和结构联系起来。在NCBI上BLAST目的蛋白序列，发现该蛋白属于mttA/Hcf106 超蛋白家族。该家族的核心区域三级结构是“L”型（图5），主要分布在双精氨酸转运系统的蛋白质中和真核生物的转移起始因子中。

用SWISS-MODEL在线工具模拟、PyMol软件得到的目的蛋白的三级结构有3个α螺旋，其主要的三维结构模型有2个（图6-A、B），但是考虑到其超家族的核心区域三级结构、TatB蛋白的跨膜分布，以及预测出来的两个跨膜结构域，认为图6（B）中的模型更正确。

3 讨 论

TatB蛋白是双精氨酸转运系统中的关键组成部分。同很多的植物病原细菌一样，西瓜嗜酸菌也具有双精氨酸转运系统，该菌中Tat的主要组成部分和大肠杆菌一样包括TatA，TatB和TatC三部分。

本研究主要对西瓜嗜酸菌TatB蛋白进行生物信息学分析，结果发现西瓜嗜酸菌中tatB基因位于基因组的1 156 059至1 156 553位碱基上，由495 bp核苷酸组成，翻译产物具有164个氨基酸残基。TatB分布在细菌细胞内膜，起移位酶的作用。它的理化性质和洋葱酸皮病菌以及茄科雷尔氏菌比较相似，而细菌的分类学上这3种细菌都曾被划分到假单胞菌属中，因此从某种程度上来说它们的TatB蛋白的遗传关系可能比较接近。但是根据图1的进化树分布，发现2种假单胞菌属的细菌跟它们之间相差得还比较远，这说明由一个蛋白或一个基因来确定进化2个物种的进化关系是不准确的。水稻白叶枯病菌的TatB蛋白与其他细菌的TatB蛋白相差比较大，所以导致其理化性质差异显著、亲缘关系比较疏远。

西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性预测、跨膜结构预测以及三级结构预测结构比较一致，试验的结构显示它具有2～3个疏水性较高的部位，2个跨膜结构域。其三级结构与它从属的超家族mttA/Hcf106核心序列区域一致，都是“L”型。

目前对大肠杆菌的Tat系统的研究比较深入，但是具体的机制还是不够明确。而很多研究报道指出Tat蛋白分泌系统关键基因的缺失会降低植物病原细菌的毒力。在已有的报道中，并没有关于人和动物的Tat系统[11]。所以对研究西瓜嗜酸菌TatB蛋白进行生物信息学分析，能够充实其分子生物学资料，对于揭示西瓜嗜酸菌的致病机制、发明新型靶标农药及培育抗性品种有重要意义。

参考文献

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